结构生物化学/磷脂酰丝氨酸结合基序和PKC

PKC受二酰基甘油和氨基磷脂磷脂酰丝氨酸的控制。磷脂酰丝氨酸特异性的分子基础被认为是由于存在一个假定的磷脂酰丝氨酸结合基序，该基序位于PKC的C2结构域中。为了确定该基序是否介导PKC与磷脂酰丝氨酸的相互作用，PKC BII中羧基末端的碱性残基被突变为丙氨酸。此外，还观察了磷脂酰丝氨酸对突变酶的调控。

膜结合和活性测量表明，突变蛋白的磷脂酰丝氨酸调控与野生型蛋白激酶C没有区别。无论是在有或没有二酰基甘油的情况下，对含磷脂酰丝氨酸膜的表观膜亲和力，还是激活对磷脂酰丝氨酸的依赖性，都没有受到共识序列羧基末端保守碱性残基去除的影响。

蛋白激酶C家族的丝氨酸/苏氨酸激酶转导了大量的细胞外信号，这些信号导致了脂类第二信使二酰基甘油的产生。这种脂类允许蛋白激酶C从胞质溶胶转移到质膜，在那里它通过与磷脂酰丝氨酸的额外相互作用而被激活。这是由两个膜靶向模块介导的：C1和C2结构域。观察这一过程的方法之一是通过诱变。通过这种方法，PKC BII中Lys 236和Arg 238被突变为丙氨酸。这是利用以pBlueScript为模板的野生型PKC BII进行PCR实现的。

另一种使用的方法是蛋白表达和细胞分级。在这个过程中，编码野生型或K236A/R238A PKC BII的重组杆状病毒在Sf-21细胞中孵育4小时，然后用培养基稀释并在27摄氏度孵育。

另一种使用的方法是表达的蛋白激酶C的Western blot分析。在这种方法中，通过Western blot分析检测PKC在洗涤剂可溶性和洗涤剂不可溶级分中的分布。提取物的样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。

另一种使用的方法是通过脂类观察，其中使用并制备了蔗糖负载的大单层囊泡，方法是将脂类在氯仿中的混合物在氮气流下干燥，然后在真空下抽真空，将脂类悬浮在20 mM HEPES中，pH 7.5，170 mM蔗糖，然后进行5次冻融循环，然后使用Liposofast微挤出机挤出。

另一种使用的方法是蛋白激酶C活性测定和蛋白激酶C膜结合测定，其中通过测量其与蔗糖负载的囊泡的结合来确定其膜亲和力。通过在相同条件下使用非依赖于辅因子的底物鱼精蛋白硫酸盐，测定上清液和沉淀物中PKC的活性，确定沉淀物的比例。在这种情况下，膜亲和力计算为游离/结合的蛋白激酶C与总脂类浓度的比率。最后，数据分析是另一种用于观察的技术。在这种技术中，使用一个程序计算游离钙，该程序考虑了Mg2+、ATP、Na+、EGTA、EDTA和pH的浓度。

参考文献：来自加州大学圣地亚哥分校药理学系和化学与生物化学系的Joanne E. Johnson、Amelia S. Edwards和Alexandra Newton