结构生物化学/聚合酶链式反应

PCR 仪/热循环仪

PCR，或聚合酶链式反应，是一种可以用来将 DNA 复制许多个数量级或在 DNA 中创建突变的技术。PCR 是生物化学家的一项宝贵技术。例如，它允许我们通过诱导突变来研究基因和 DNA 片段的影响。此外，由于 PCR 可用于扩增极少量的 DNA，因此它是法医科学家的有用工具。PCR 通过热循环快速扩增 DNA。使用热循环仪，可以通过许多循环持续改变温度。这使得热循环仪能够解离双链 DNA，使引物与之退火，然后激活 DNA 聚合酶以复制 DNA。通过多次重复此过程，DNA 以指数方式复制，使我们能够进一步研究它。

DNA 的 PCR 扩增经历三个阶段

1. DNA 变性：两个 DNA 链通过加热（94^oC）分离。

2. 寡核苷酸退火：当加热的 DNA 链冷却时（50-60^oC），两个互补的寡核苷酸（引物）被添加到每个侧翼序列。

3. DNA 聚合：耐热 DNA 聚合酶催化 5'-3' DNA 合成（70^oC）。

经过 PCR 扩增后，目的基因被限制性内切酶切割并连接到质粒克隆载体。然后将重组质粒置于细菌宿主中并进行繁殖。

除了 DNA 扩增外，PCR 还可以在 DNA 中创建突变和缺失，以及引入限制性内切酶位点。

历史

前四个 PCR 循环的示意图
1) 在 96°C 下变性。
2) 在 68°C 下退火。
3) 在 72°C 下延伸（P=聚合酶）。

第一个循环完成。两个产生的 DNA 链构成下一个循环的模板 DNA，因此每个新循环复制的 DNA 量增加一倍。

1. 变性

DNA 变性是指加热双链 DNA 并形成两个独立的单链。

基本上，这个过程打破了双螺旋碱基之间的氢键，以克服使碱基如此紧密堆叠在一起的能量。存在许多变性技术，并且是可能的。最流行和常用的技术是简单地将 DNA 的温度提高到其熔点 Tm 以上。然后碱基对解堆叠，可以使用分光光度法监测。DNA 在 260 纳米处被强烈吸收，并且随着 DNA 继续熔化，其吸光度增加，因为单链在较高的波长处被吸收，然后一旦完全分离，它就保持不变。这个过程被称为低热效应。整个技术可以逆转，因此 DNA 可以重新自然化一段时间，从而根据时间估计碱基组成。DNA 变性的主要生物学原因是复制和转录。

2. 退火

当温度降低到 Tm 以下时，分离的互补核酸链自发地重新缔合形成双螺旋。这种重组过程称为退火。对于 PCR 反应，通常的退火时间为 30-45 秒。将此时间增加几分钟不会影响 PCR 结果。另一方面，由于聚合酶在 45 到 65o C 之间具有一定的活性降低（大多数退火过程的温度区间），因此更长的退火时间可能会增加非特异性扩增产物的可能性。退火温度是 PCR 反应中需要调整的最重要参数之一。此外，此参数的灵活性允许在存在可变量的其他成分（尤其是模板 DNA）的情况下优化反应。退火温度对于查找和记录多态性很重要。两个引物用于扩增 DNA 基因座的两个序列中的轻微错配（即使是 1 个碱基对突变）可以通过退火温度的轻微变化和/或通过多重 PCR 来检测。

3. 聚合

聚合是一个流行的过程，这意味着需要能量输入才能实现它。除了核苷酸外，还需要糖磷酸酯的连接。最后，它需要一种酶，称为 DNA 聚合酶。三磷酸核苷酸使聚合过程成为可能。这些三磷酸核苷酸在细胞核内自由漂浮，每个 DNA 碱基都以三磷酸核苷酸的形式存在。三磷酸键断裂释放的能量为 DNA 聚合提供了能量。

PCR 是 Kary Mullis 在 1983 年提出的一个想法，当时他还是加利福尼亚州伯克利 Cetus 公司的员工。 据穆利斯说，他是在开车时想到这种 DNA 扩增技术的。Cetus 公司看到了这种方法的巨大潜力，并将穆利斯和其他科学家从他们的工作中抽调出来，专门专注于完善 PCR。

这些科学家花了一年的时间研究 PCR，但他们遇到了许多障碍。 其中一个问题是使用最初从大肠杆菌获得的 DNA 聚合酶。然而，PCR 需要加热来解离 DNA 链，但这种加热还会使 DNA 聚合酶失活。因此，每次运行都需要添加 DNA 聚合酶，总共需要大量的 DNA 聚合酶才能完成整个聚合酶链式反应。然而，从嗜热菌（Thermus aquaticus）中纯化和分离的 Taq 聚合酶的发现导致 PCR 技术的显着改进，因为 Taq 聚合酶在高温下稳定，因此实际上消除了在每个循环后添加 DNA 聚合酶的需要，并使该技术能够有效地自动化。

1984 年，使用 Southern 印迹分析了第一次 PCR 的结果，结果表明 PCR 扩增了目标序列。克隆结果也证明 PCR 增加了这种数量，同时在最终结果中仍保持高精度。PCR 专利于 1987 年获得批准。 1985 年 12 月，Cetus 开始生产商用 PCR 仪器，此后，PCR 开始进入法医科学领域。1986 年，爱德华·布莱克在“宾夕法尼亚州诉佩斯蒂尼卡斯”一案中使用了 PCR，1989 年，阿莱克·杰弗里斯开始从旧案中扩增 DNA，从而提高了测试的灵敏度，并允许无辜的囚犯获得自由。

因其对基于 DNA 的化学的贡献以及对 PCR 技术的开发，Kary Mullis 获得了 1993 年诺贝尔化学奖。

PCR 的变体

定量实时 PCR (qPCR): 定量 PCR 是一种 PCR 技术，其中 DNA 样本被同时扩增和定量。一般步骤与原始 PCR 相同，然而，在 qPCR 中，扩增的 DNA 样本在反应进行时被实时检测，而在常规 PCR 中，样本在反应结束时被测量。 qPCR 中使用两种常见的方法： (1) 使用荧光染料，这些染料与任何双链 DNA 片段结合（例如，EvaGreen 染料 ）和 (2) 特定的荧光标记探针，只有在与互补 DNA 链杂交后才能检测到。对于这两种方法，测量的荧光增加与 DNA 样本增加成正比。这种 PCR 方法比常规 PCR 更有效且更精确，因为检测是实时发生的，不需要在 Southern 印迹上运行样本的额外时间。qPCR 的应用有很多，包括但不限于癌症和基因异常等核酸疾病的快速诊断。

逆转录 PCR (RT-PCR): 逆转录 PCR 是一种 PCR 技术，用于扩增、检测和定量 mRNA。 PCR 首先在开头进行修改，首先通过逆转录酶将 RNA 转换为 cDNA。反应的这部分可能与 PCR 在同一个试管中进行，也可能不在同一个试管中进行。下一步遵循 PCR，解离双链 cDNA，使引物结合，并激活 DNA 聚合酶以扩增样本中 DNA 的数量。 与 PCR 一样，反应产物可以实时查看，使用 SYBER Green 等荧光染料，或者可以在反应后评估产物。 该反应的效用是扩增给定样本中 RNA 的数量。此外，由于该反应的产物是编码蛋白质的基因模板，因此此序列可以插入原核生物中以进行蛋白质生产等。

降落PCR：降落PCR是原始PCR技术的改进，反应最初在退火引物熔化的温度下进行。在随后的循环中，温度逐渐降低，每次降低大约1摄氏度，直到达到特定温度，即降落温度。 该技术的实用性在于它允许早期积累特异性产物，这些产物随后作为模板用于后期的PCR扩增，从而降低非特异性PCR产物的生成。

逆向PCR：逆向PCR是原始PCR技术的一种变体，其中已知要扩增的DNA的一个内部序列。原始PCR的一个限制是，它需要与要扩增的DNA的末端序列互补的引物。 然而，该技术的实用性在于，如果只鉴定出一个位点，那么仍然可以进行PCR。这可以通过用限制性内切酶消化DNA的末端，并用DNA连接酶连接DNA的两个自由末端来实现，从而产生一个环状DNA。然后，用另一种限制性内切酶切割已知的内部序列，从而产生一条DNA链，其末端序列已知，这使得可以通过PCR扩增目标序列。

解旋酶依赖性扩增 (HDA)：解旋酶依赖性扩增是一种类似于PCR的方法。然而，HDA的不同之处在于它依赖于解旋酶来分离DNA，而不是加热DNA使其变性。因此，它是一种在恒定温度下进行的PCR方法。 因此，方法类似，解旋酶将双链DNA分离成单链，引物与之退火，然后扩增DNA。该技术的实用性在于它几乎可以在任何地方进行，例如在犯罪现场，而PCR只能在实验室环境中进行，因为它需要大型、昂贵、笨重的机器。 然而，尽管有这些积极的品质，HDA的使用并不像PCR那样广泛，因为大多数这类反应，无论是来自犯罪现场还是医院，通常都在实验室进行。此外，HDA的样本量不及PCR，而且HDA相对比PCR更昂贵。

嵌套PCR：嵌套PCR是PCR的一种变体，用于最大程度地减少引物结合到DNA序列中错误位置并产生污染的结果。该反应首先用一对引物进行，这些引物与DNA的不同位置结合，但重要的是它们结合在要扩增的感兴趣序列的外部。 在第二个循环中，使用另一对引物结合到第一对引物内部的特定DNA序列上，并扩增该序列。该技术的原理是，如果一个随机序列被第一对引物意外扩增，那么第一对引物之间的内部序列被第二对引物扩增的概率非常低，从而有效地最大程度地减少了副反应的污染。

应用

检测进化关系：PCR可用于扩增化石中发现的少量DNA。这种扩增的DNA可以被测序。使用生物信息学中的技术，这种新测序的DNA可以与其他古代生物以及现代生物进行相似性测试。这些比较揭示了古代物种是哪些现代物种的共同祖先，以及它与哪些其他古代物种密切相关。PCR消除了生物信息学只分析现代生物DNA的限制，并使远距离进化关系更容易识别。

检测癌细胞的存在：如果无法确定组织样本中是否存在癌细胞的痕迹，可以从样本中分离并纯化DNA。可以对纯化的DNA进行PCR。扩增的DNA更容易检测到已知会导致癌症的某些突变（在生长基因中）。这不是检测癌症的万无一失的方法（一些癌细胞可能没有任何“致癌突变”清单），但关键是PCR使在样本量过小时，检测突变的存在成为可能。

受害者血液在嫌疑人衣服上 = 有罪！！（可能）

法医：从犯罪现场某个地方获得的少量DNA（例如嫌疑人衣服上的血迹）可以用PCR扩增，并与受害者和嫌疑人的DNA进行比较。一滴血或一根头发的片段可能没有足够的DNA进行检测，但PCR使检测这种少量DNA成为可能。对DNA进行测序过于繁琐，因此使用限制性内切酶来创建DNA指纹。将DNA样本置于一种或多种限制性内切酶中，持续一定时间。限制性内切酶在它们的识别序列处切割DNA，但不是在所有识别序列处切割（如果时间更长，它们就会切割）。如果DNA不同，酶会切割不同长度的DNA，如果DNA相同，酶会切割两个样本中相同长度的DNA。将每个样本的DNA片段通过凝胶，并进行比较。这可以提供强有力证据，证明嫌疑人是无罪的还是有罪的。