结构生物化学/多核苷酸激酶/磷酸酶酶
在生物体中，最常见的问题之一是细胞 DNA 损伤，即突变。突变非常普遍，与生命中各种重要的因素有关，例如癌症治疗、神经系统疾病和衰老。DNA 损伤的基本原理是，内部和外部因素导致碱基丢失，从而导致 DNA 链断裂。在修复链断裂之前，断裂的末端需要进行处理，才能正确地替换缺失的碱基。这就是多核苷酸激酶/磷酸酶 (PNKP) 发挥作用的地方，它通过催化 5'-磷酸和 3'-羟基末端的恢复来发挥作用。PNKP 与各种其他蛋白质相互作用，特别是 XRCC1 和 XRCC4，并利用不同的途径修复 DNA。PNKP 的 5' 激酶和 3' 磷酸酶活性处理或修复 DNA 中的单链和双链末端。了解其机制为治疗疾病和癌症提供了机会。已知 PNKP 抑制剂会使细胞对 IR 和化疗药物敏感，因为它们阻止 PNKP 处理 DNA 修复。PNKP 在 DNA 链断裂修复中的作用遵循三种主要的 DNA 修复途径：单链断裂修复 (SSBR)、碱基切除修复 (BER) 和双链断裂修复 (DSBR)。这三种机制可以提供有关其他蛋白质如何结合和与 PNKP 酶反应的有用信息。[1]
PNKP 是一种多结构域酶，由两个主要结构域组成：N 端叉头相关 (FHA) 结构域和 C 端催化结构域。此外，C 端催化结构域由融合的磷酸酶和激酶亚结构域组成。两个主要结构域，FHA 和催化结构域，通过一个灵活的多肽段连接。正是这种连接部位使 PNKP 能够结合其他蛋白质的 CK2 磷酸化区域。多核苷酸激酶磷酸酶和噬菌体 T4 多核苷酸激酶（一种克隆酶）的不同之处在于，T4 酶不包含 FHA 结构域，而 PNKP 在 N 端包含 FHA 结构域。然而，T4 多核苷酸激酶的激酶亚结构域位于 N 端，而不是 C 端催化结构域。 [1] PNKP 相互作用的两种特定蛋白质被称为 XRCC1 和 XRCC4。XRCC1 和 XRCC4 的主要区别在于 XRCC1 修复 DNA 单链断裂，而 XRCC4 蛋白修复 DNA 双链断裂。 [1] 只有 FHA 结构域能够结合这些蛋白质中 CK2 特异性磷酸化的区域。对于 XRCC1，CK2 的聚集区域通常位于 515 到 526 残基之间，这是 XRCC1 结合 FHA 和修复 DNA 所必需的。相反，XRCC2 仅需要一个主要的 CK2 位点。此外，aprataxin 和 aprataxin 以及 PNKP 样因子 (APLF) 有助于 DNA 修复；这两个 DNA 修复因子也具有 FHA 结构域。 [1]
PNKP 还包含两个催化活性位点，位于酶的同一侧，以及独立的 ATP 和 DNA 结合位点。噬菌体和哺乳动物酶之间的不同 DNA 结合位点有很大差异。对于噬菌体酶，结合位点通过一个狭窄的通道发生，该通道通向催化天冬氨酸残基，这仅有助于单链修复。至于哺乳动物酶，它们磷酸化 5'-羟基末端，修复双链的效率高于单链。
具体来说，对于 IR 诱导的链断裂，核苷酸的丢失是通过一个过程修复的，该过程由聚（ADP 核糖）聚合酶 (PARP)、XRCC1 和 AP 核酸内切酶 I (APE1) 完成。这个过程可以使用短片段完成，使用 DNA 聚合酶和 DNA 连接酶 III。它也可以使用长片段完成，使用 DNA 聚合酶、连接酶 I 和 FEN1 核酸内切酶。APE1 的作用是去除 3'-磷酸甘油酸。PNKP 本身在 3'-磷酸基团中执行水解，同时保持 5'-OH 磷酸化，这比 APE1 的活性强得多。总的磷酸酶活性明显高于激酶活性，导致磷酸酶缺陷型 PNKP 的过表达。
SSBR 的基本机制是
- 断裂由 PARP 识别
- 识别仅吸引 XRCC1，XRCC1 通常与 DNA 连接酶结合
- XRCC1 招募 PNKP/APE1
- 招募的酶恢复末端，使 DNA 聚合酶能够添加缺失的核苷酸，并使 DNA 连接酶能够结合断裂的链。
处于压力或损伤状态的细胞确实需要 CK2 磷酸化的 XRCC1 结合 PNKP 的 FHA 结构域，以便进行修复。非压力细胞能够应付非磷酸化蛋白质，因为修复没有迫切需要。
双链断裂修复途径依赖于蛋白质 XRCC4，XRCC4 在磷酸化后不会刺激酶 PNKP；相反，非磷酸化 XRCC4 会激活 PNKP。然而，磷酸化 XRCC4 与 DNA 连接酶 IV 的组合可以通过促进 PNKP 的 FHA 结构域与磷酸化 XRCC4 蛋白之间的结合来触发 PNKP。 [1] PNKP 仅参与 DSBR 的非同源末端连接 (NHEJ) 途径，但不参与同源重组。该机制类似于 SSBR，不同之处在于 PNKP 的激酶活性是连接发生所必需的。此外，磷酸化实际上依赖于 XRCC4，而不是 XRCC1，以便将 PNKP 结合到 DNA 连接酶，从而刺激 DNA 连接酶。还应该注意的是，XRCC4 是 IR 或化疗处理后细胞存活所必需的。关于 DSBR 最重要和最独特的事实是，磷酸化 XRCC4 实际上无法通过 FHA 结构域与 PNKP 结合，从而抑制细胞修复。然而，添加 DNA 连接酶可以逆转这种抑制，因此可以成功地进行 DNA 修复。
DSBR 的非磷酸化 XRCC4 的作用方式类似于单链断裂修复 (SSBR) 中的 XRCC1，因为它们都鼓励多核苷酸激酶/磷酸酶 (PNKP) 的酶促细胞周转。虽然非磷酸化 XRCC4 对 PNKP 的 T 末端叉头相关 (FHA) 结构域具有吸引力，但磷酸化 XRCC4 具有更大的吸引力，这更有利于 DNA 双链修复。总之，非磷酸化和磷酸化 XRCC4 与 DNA 连接酶和 PNKP 共同以一种复杂的方式协同工作，以修复 DNA 末端。
由电离辐射、活性氧和烷化剂引起的多数次要碱基修饰的修复是通过碱基切除修复 (BER) 过程进行的。该过程的第一步涉及 DNA 糖基化酶及其去除修饰的碱基。然后，通过 AP 核酸内切酶 I (APE1) 在新形成的脱嘌呤/脱嘧啶 (AP) 位点切割 DNA。当发现 nei 核酸内切酶 VIII 样 1 (NEIL1) 和 NEIL2 哺乳动物 DNA 糖基化酶时，PNKP 的存在及其在 BER 途径中的作用变得明朗，这些蛋白质有助于诱导 3'-磷酸末端。NEIL 1 和 NEIL 2（分别为 nei 核酸内切酶 VII 样 1 和 2）可以形成包含 PNKP 或其他 BER 成分的复合物。NEIL 1 和 NEIL 2 通过切除或切除受损的 DNA 碱基，然后去除错误来修复 DNA。NEIL 糖基化酶之间的竞争可能导致不依赖于 APE1（AP 核酸内切酶 1）的碱基切除修复途径。 [1] 这两种新发现的蛋白质，虽然被发现不直接与 PNKP 结合，但被发现与 BER 过程的更大组分相关，其中包括 PNKP。这些糖基化酶能够切割非碱基对位点，并导致 PNKP 耗尽的细胞对甲基甲磺酸 (MMS)（一种烷化剂）敏感。PNKP 在 BER 中的确切功能尚不清楚，但通过更深入地研究 NEIL1 和 NEIL2，这些蛋白质可能提供有关 PNKP 在这种修复途径中的作用和功能的解释。
通过PKNP复杂的结构，我们可以了解到它在修复受损的松散DNA链方面的复杂功能。PKNP在人类临床研究中可以发挥的创新作用之一是，它可以帮助细胞抵抗辐射损伤，这在癌症化疗的临床领域中可能会有益。由于PKNP在肿瘤细胞重建中的作用，近年来，许多PKNP抑制剂以及其他DNA修复蛋白抑制剂引起了人们的兴趣，目的是使肿瘤和癌细胞更容易受到辐射攻击。当这些恶性细胞变得更加脆弱时，放射治疗的效果会更加显著，患者体内的癌症更有可能缓解。抑制剂可能对抗的癌症类型包括卵巢癌和结肠癌，这两种癌症比较常见。虽然PKNP修复DNA的作用对正常细胞非常有益，但DNA修复抑制酶的相反作用在试图根除癌症和肿瘤细胞时也是有帮助的。
当PKNP（非同源末端连接、单链断裂修复和碱基切除修复）中的一条或多条途径发生突变或功能中断时，与人类严重的脑神经疾病相关，这对正常发育有害。例如，酶LIG4的突变与小头畸形相关，小头畸形是一种婴儿出生时头围比正常或自然状态小得多的疾病。在小鼠中，当酶XRCC1（必须先磷酸化，然后与PKNP的FHA结构域结合）被删除时，会导致癫痫。一项最新研究发现，常染色体隐性小头畸形、婴儿期发作性癫痫和发育迟缓（MCSZ）是由PKNP酶两个结构域的突变引起的。由于突变组合可能来自磷酸酶或激酶结构域，甚至两者都有，因此受影响个体的许多症状也有所不同。通过MCSZ的各种症状，表明PKNP可以通过多种酶修复途径（DSBR、SSBR和BER）发挥作用。
PKNP的突变会导致常染色体隐性神经系统疾病，因此PKNP水平升高可以修复活性氧（ROS）的影响，活性氧是含有氧分子的自由基，会导致体内DNA、蛋白质和脂质氧化。镉和铜水平的升高会造成损害和神经毒性，从而导致PKNP抑制，而PKNP是修复人类细胞中DNA链断裂的酶，因此增加了患癌的可能性。[1] 另外两项研究表明，PKNP可以被自然存在的镉和铜含量变性。从生理角度来看，镉和铜实际上具有有害的致癌和神经毒性作用，这似乎与PKNP的功能相矛盾。镉和铜的积累会阻止PKNP正常发挥作用，因此当细胞无法修复DNA链断裂或修复错误时，通常会导致癌症。[1]