结构生物化学/RNA 聚合酶 II
虽然人们普遍认为转录调控发生在基因编码区的邻近区域，主要是通过启动子和增强子，并且聚合酶充当快速“读取基因”的机器，但最近的证据表明，这个过程远不止如此。
转录延伸非常复杂且受到高度调控，这个过程意义重大，因为它会影响基因组的组织和完整性。本文将探讨 RNA 聚合酶 II 转录延伸的一些错综复杂之处，这些在一段时间内被忽略了。
RNA 聚合酶 II 转录循环可以分为几个不同的步骤
- RNAPII 被募集到基因的启动子区域，在那里它与通用转录因子形成预起始复合物
- 此时，起始开始，启动子在称为“启动子清除”的过程中被留下
- RNAPII 进入进行性转录延伸，基因被完全转录
- 然后，转录终止发生，导致 RNAPII 释放和循环利用
RNAPII 面临的挑战
- 聚合酶需要逃脱启动子
- 前 mRNA 转录本的产生需要与 RNA 生物合成紧密耦合。这包括 RNA 加帽、剪接、转录本切割和聚腺苷酸化。
- RNAPII 必须在染色质中绕过核小体和其他障碍（如 DNA 损伤），因为转录延伸发生在染色质中
- 转录受 DNA 代谢过程的影响：DNA 修复、重组和复制。
- 高度转录基因中的转录延伸由几个聚合酶分子同时进行，因此必须调节基因“流量”。
这种机制控制着转录延伸。它涉及通过正确传入核苷酸的结合和水解来稳定正向转运状态。这种机制的问题是，尽管它快速向前移动，但也可能向后移动。因此，即使形成了新的磷酸二酯键，酶也可以回溯一个或多个核苷酸，从而使新形成的 3' 末端与活性位点错位。布朗运动可以使 RNA 与活性位点重新对齐。通用延伸因子会影响不同酶状态之间的多个平衡，这有助于推动反应朝着正向转运方向进行。
转录保真度至关重要，因为在延伸过程中将正确的核苷酸插入 RNA 转录本对于基因表达的准确性至关重要。
RNA 聚合酶 II 有几个关键结构，可以确保保真度
- 触发环
- Rpb9（RNAPII 上的亚基）
- 转录因子，尤其是被称为 TFIIS 的转录因子
- RNA 聚合酶 II 本身
触发环位于活性位点下方，参与与传入核苷酸的多个相互作用。触发环在保真度中起着关键作用，活性位点中的错配核苷酸无法与环正确对齐，因此导致磷酸二酯键形成速率大大降低。因此，触发环以这种方式介导磷酸二酯键形成。触发环区分 dNTP 和 rNTP 碱基，并与 2'OH 相互作用。
RNAPII 上的另一个重要结构是 Rpb9 亚基，它最初是由研究酵母菌株的科学家发现的。Rpb9 会延迟传入核苷酸上触发环的闭合，这有助于通过为修复错误提供更多时间来确保转录保真度。
RNAPII 本身在其自身的转录保真度中起着关键作用，因为这种聚合酶可以在它转录的分子上向前和向后移动，因此可以通过错误掺入的核苷酸的转录本切割来纠正任何错误。转录因子被称为 TFIIS，它极大地增强了转录本切割。最近的研究还表明，TFIIS 在保真度过程中也发挥作用，因为它们与 Rpb9 的功能紧密耦合，这让我们相信 Rpb9 可能在核苷酸添加之前和之后通过影响触发环的功能以及通过介导 TFIIS 功能来参与 RNAPII 保真度。
转录延伸发生在染色质模板上，染色质是对转录过程极其抑制的模板。因此，必须利用某些机制来使它成为一个更适合转录发生的友好场所。这涉及核小体的暂时位移和修饰/解体。这可以通过几种不同的机制发生，并且需要；
- 组蛋白伴侣
- 染色质重塑因子
- 组蛋白修饰酶
这些相同的因子也有助于在 RNAPII 转录后重置染色质结构。
首先，H3-H4 二聚体被 HAT1-RbAp48 复合物乙酰化。然后，大多数 H3 和 H4 蛋白被传递给 Asf1、CAF-1、yRtt106 和 HIRA，以介导染色质组装。CAF-1、yRtt106 和 HIRA 之间的选择取决于 H3 的变体。例如，H3.1 靶向 CAF-1，而 H3.3 靶向 HIRA。CAF-1 和 yRtt106 与 DNA 合成相关联，而 HIRA 发生在 DNA 合成之外。组蛋白传递给不同的组蛋白伴侣取决于特定的乙酰化标记 H3 K56Ac。H3 K56Ac 在酵母中的作用是在 DNA 修复和复制期间驱动染色质组装。然而，由于 H3 K56Ac 在人类中更难检测，因此仅推测它将执行相同的任务。对于 H3 K56Ac，Asf1 将组蛋白传递给 CAF-1 或 Rtt106 的可能性更高。DNA 合成依赖性途径或合成独立性途径的选择取决于伴侣之间的物理相互作用。传递中的最后一个伴侣将组蛋白放置在 DNA 上。有用于放置组蛋白的 DNA 位置的机制，以及用于增加组蛋白浓度的机制。 [1]
其中一个机制是延伸的RNAPII前方的核小体解体；某些实验证明了这是一个机制。一个这样的实验测量了酵母GAL基因的组蛋白密度，结果表明基因激活会导致启动子和编码区内核小体的丢失。这种组蛋白密度的丢失是由延伸的RNAPII引起的。对酵母中核小体占有率的全基因组分析表明，转录速率和组蛋白密度呈负相关，进一步证明了核小体在转录过程中被解体。另一个机制是在转录过程中所有核心组蛋白的置换。然而，存在不同类型的二聚体。H2A/H2B二聚体定位在核小体的外部，并且具有较少的蛋白质-DNA接触。这些二聚体响应转录因子而快速交换。相反，组蛋白H3和H4的移动性要小得多，它们的周转率与H2A/H2B二聚体完全无关。因此，虽然在此过程中所有核心组蛋白都被置换，但H2A/H2B组蛋白更容易移动，而H3/H4则不会。
就像核小体组装过程以逐步的方式发生，并伴随着组蛋白伴侣一样，核小体解体过程也是一个逆向的逐步过程。核小体组装和解体之间最显著的区别在于，核小体解体需要能量。能量是用来破坏组蛋白-DNA键，以便组蛋白伴侣可以与组蛋白结合并将其从DNA上移开。在进行解体之前需要考虑的因素是组蛋白的翻译后修饰和组蛋白伴侣的可用性。这是一个平衡问题。如果只有H2A-H2B的平衡偏向于从DNA上移除，那么就只会发生组蛋白交换。但是，如果H3-H4的平衡偏向于从DNA上移除，那么就会发生核小体解体。启动子区域的H3 K56Ac是核小体解体中一个常见的例子，因为它使H3-H4的平衡偏向于从DNA上移除。这种平衡受到所有相互作用的影响，包括组蛋白-组蛋白伴侣相互作用、组蛋白-DNA相互作用或组蛋白-组蛋白相互作用。[1]
组蛋白伴侣
[edit | edit source]组蛋白伴侣是参与细胞内组蛋白动力学的组蛋白结合蛋白，最近的证据表明，一种被称为FACT的组蛋白伴侣在转录延伸中起着巨大的作用。FACT（促进染色质转录）是一种组蛋白伴侣，它通过破坏核小体结构来促进延伸，以便在RNAPII通过时移除H2A/H2B二聚体。Spt6是一种H3和H4组蛋白伴侣，它维持染色质结构，促进在RNAPII转录延伸之后恢复正常的染色质结构。总的来说，组蛋白伴侣参与了转录延伸过程中组蛋白的移除和重新沉积。
组蛋白伴侣作为蛋白质不仅将组蛋白和DNA包装到核小体结构中，而且还解体这种结构。组蛋白和DNA在核小体中以某些方式折叠在一起，组蛋白伴侣帮助监督每一步。H2A、H2B、H3和H4是组蛋白。组蛋白伴侣协助从DNA上形成H3-H4异四聚体的四聚体。四聚体与H2A-H2B二聚体结合形成核小体。组蛋白伴侣非常重要，因为如果没有它们的帮助，带正电的组蛋白会与带负电的DNA形成聚集体。组蛋白具有疏水部分和轻微酸性部分的事实使得该蛋白质更容易被DNA吸引。组蛋白伴侣虽然在序列上不相似，但可以在结构上分为β-折叠夹心伴侣、α-耳罩伴侣、β-螺旋桨伴侣以及β-桶和半桶伴侣。[1]
β-折叠夹心伴侣
这种结构的特征是酿酒酵母Asf1的N端核心域，并且没有酸性尾巴。通过诱变和NMR化学位移证实，组蛋白结合发生在Asf1的疏水和酸性表面。H4的C端尾巴可以与yAsf1β-折叠或H2A微型β-折叠结合。因此，yAsfi可以进入H3-H4二聚体并形成结构上保守的复合物。人类ASF1a的晶体结构揭示了这种复合物。Asf1将H3-H4二聚体传递给其他组蛋白伴侣，如CAF-1或HIRA。Asf1调节转录、复制和修复。除了Asf1，Yaf9是β-折叠夹心伴侣中的另一种伴侣。Yaf9在H2AZ乙酰化和沉积到常染色质启动子区域中起作用。它还包含结构上保守的特征，这些特征可以作为H3-H4结合位点并调节转录。[1]
α-耳罩伴侣
该组负责将组蛋白从细胞质中传递、与H1结合以及组装和解体核小体。这些伴侣的特点是它们使用长α-螺旋进行二聚化并连接αβ耳罩基序。诱变证实了组蛋白结合位点位于耳罩域的中央和底部表面。Vps75是该组中的一种伴侣，它与H3-H4二聚体结合。它参与H3 K56的乙酰化，进而帮助包装过程。除了乙酰化，Vps75还负责调节转录、修复和维持端粒长度。在Vps75中，耳罩域比NAP1更靠近。NAP1负责转录、H2AZ交换、连接子组蛋白沉积和组蛋白传递。[1]
β-螺旋桨伴侣
该组的特征是酸性区域，这些区域不像其他伴侣那样明显。核质蛋白负责调节核仁事件以及在诸如卵子发生、精子染色质解压缩和核小体组装等事件期间的组蛋白储存。核质蛋白的五聚体N端具有自组装成十聚体的能力。核质蛋白核心与连接子组蛋白和核心组蛋白协同工作，产生五个组蛋白八聚体。除了具有β-螺旋桨伴侣结构，CAF-1和RbAp46在N端有一个α-螺旋。这些伴侣在顶部带负电，在底部带疏水性。H4α-螺旋在伴侣的α-螺旋和酸性区域的结合环之间结合。因此，H3-H4二聚体结构被破坏。为了抵消这种情况，这些伴侣承担着将H3-H4二聚体与几个染色质修饰复合物（如HAT1、PRC2、NURD和NURF）结合在一起的角色。[1]
β-桶和半桶伴侣
这个家族包括FACT亚基Spt16、Pob3、Nhp6、SPT16和SSRP1。FACT这个词基本上意味着这些伴侣促进染色质转录。Pob3的结构包括一个螺旋盖的β-桶，这有助于它与酵母复制蛋白A（RPA）复合物结合，以协助复制。Spt16具有连接的氨基肽酶和皮塔面包域。Rtt106与H3 K56上乙酰化的组蛋白结合。它的H3-H4结合位点位于C端域的一个环中。[1]
组蛋白变体伴侣Chz1
该组蛋白伴侣组的特点是没有定义的序列或结构。Chz1是一种H2AZ-H2B结合蛋白。NMR证实了Chz1的独特结构，即α-螺旋，它们主要与H2AZ-H2B二聚体的一个表面结合，具有高亲和力。因此，它的解离速度比它的结合速度慢。[1]
组蛋白伴侣的寡聚状态取决于核小体组装的阶段。组蛋白伴侣-组蛋白结合可以是简单的，也可以是多聚体的。弱的单个结合累积起来形成高亲和力的多聚体结合。虽然Asf1和Chz1都是单体的，但它们在核小体组装中发挥不同的作用。Asf1阻止H3-H4四聚体形成。H3通常会在组蛋白八聚体内部二聚化，但Asf1与H3结合，使其暴露于其他组蛋白伴侣。一旦Asf1释放，H3-H4四聚体就可以与连接的Rtt106和CAF1一起形成。在这个阶段之后，四聚体沉积到DNA上。另一方面，Chz1与H2AZ-H2B的已经暴露的组蛋白八聚体表面结合。因此，组蛋白直接沉积到四聚体上。[1]
- αβ耳罩伴侣在体外组装核小体。NAP1不仅组装组蛋白八聚体，而且还组装四聚体。NAP1通过H2A-H2B或
H2AZ-H2B组装组蛋白八聚体。NAP1通过H3-H4和DNA组装组蛋白四聚体。当周围有H2A-H2B时，这个过程就不那么有利了。Vps75不同于NAP1，它对H3-H4更特异，对其他组蛋白的亲和力更弱。NAP1通过一个表面与所有具有共同组蛋白折叠的组蛋白结合。这也是它与FACT不同的点，因为FACT与多个组蛋白的多个表面结合。FACT在体外和体内执行不同的功能。在体外，FACT去除H2A-H2B二聚体。然而，在体内，FACT在转录延伸、修复和复制过程中将H2A-H2B二聚体放到DNA上。[1]
- dCAF-1 p55和hCAF-1 RbAp48亚基中只有一个H4结合位点，但有多个H3结合位点。H4的单一结合位点位于H3-H4的相反面
二聚体。这使得CAF-1亚基能够到达与ASf1结合的组蛋白二聚体或沉积到DNA上的组蛋白四聚体。
- Np组装成五聚体的二聚体。这些组蛋白伴侣的每个面都可以结合一个八聚体。Np与H2A-H2B二聚体结合，N1与H3-H4四聚体结合形成八聚体。NASP，
核自身抗原精子蛋白，与 H3/H4 结合并帮助核小体组装过程。[1]
组蛋白伴侣引导的折叠途径
组蛋白伴侣在引导组蛋白-DNA 折叠过程中极其重要，因为如果没有它，组蛋白会形成充当动力学陷阱的中间体。核小体组装是一个能量有利的过程，为了保持这种方式，组蛋白伴侣需要防止这些阻止组蛋白与 DNA 结合的动力学陷阱。这些动力学陷阱能量低，组蛋白从这些动力学陷阱中出来并结合在 DNA 上在能量上不利，因为它在这些中间体中更稳定。组蛋白伴侣使组蛋白-DNA 复合物以最稳定和低能量的方式折叠。到达 DNA 动力学陷阱是一个能量下降的过程，途径中的能量更低，所以如果没有组蛋白伴侣的帮助，组蛋白就会卡在该中间体中，永远无法到达目的地。组蛋白伴侣与 ATP 依赖性染色质重塑体协同工作。在动力学陷阱中，它们有助于将组蛋白带回正确的途径。由于动力学陷阱的能量较低，染色质重塑体通过提高其能量将这些中间体清除。这些染色质重塑体在破坏组蛋白-DNA 键方面也很有用。组蛋白上的某些乙酰化标记或增加或降低结合亲和力，并根据核小体是否需要经历组装或分解来移除。 [1]
ATP 依赖性染色质重塑复合物（重塑体）利用 ATP 的能量来改变染色质的结构。
重塑体主要有四个家族
- SWI-SNF
- ISWI
- CHD
- INO80/SWR
一个被称为 RSC 的 SWI-SNF 重塑体可以在一个简单的重构染色质转录系统中通过单核小体刺激 RNA 聚合酶 II 转录延伸。组蛋白乙酰化会增强这一点，因为它会增加 RSC 对核小体的亲和力。重塑体 Chd1 与活跃转录位点的染色质相关联，并且它也参与转录延伸，因为它与延伸因子 Paf、DSIF 和 FACT 相互作用。
组蛋白的共价修饰是另一种改变染色质结构的方式，它不涉及组蛋白的去除和替换。相反，它通过影响核小体间的接触或改变静电荷来改变染色质的包装。以及使用共价连接的基团作为延伸相关效应复合物的结合表面。
上述可以通过以下三种机制实现
- 组蛋白乙酰化
- 组蛋白甲基化
- 组蛋白泛素化
Selth，Luke A. Sigurdsson，Stefan。Svejstrup，Jesper Q。“RNA 聚合酶 II 的转录延伸”。生物化学年度评论 2010 年。第 79 卷：271-293。2010 年 4 月 1 日。DOI：10.1146/annurev.biochem.78.062807.091425