结构生物化学/短RNA
短RNA在生物化学中起着重要作用。短RNA包括转移RNA、小核RNA、微RNA和其他RNA。在本节中，我们将讨论如何使用Helicos单分子测序技术来分析短RNA。为了延长RNA链，科学家使用剪接和3'端加工方法。还有许多非蛋白质编码RNA的长度小于200nt；它们可以被称为短RNA。
在RNA分离中，科学家希望从总RNA或培养细胞中纯化sRNA。因此，他们使用某些材料来进行这项技术。它们是mirVana™ miRNA分离试剂盒、miRNeasy Mini试剂盒、RNA/DNA试剂盒。RNA/DNA试剂盒可用于从总RNA中分离大量sRNA。然后，人们使用TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳和过夜洗脱从每个试剂盒中获得sRNA。在制备cDNA的过程中，科学家使用大肠杆菌PolyA聚合酶和100 mM CTP底物。然后他们应用称为ThermoScript的反转录酶过程。因此，使用5 M乙酸铵与苯酚、氯仿和异戊醇一起使用。并且还使用cDNA合成引物和RNase A。此引物的序列由整合DNA技术创建，其序列为 TCG CGA GCG GCC GCG GGG GGG GGG GGrG rGrG。在分析3'端sRNA时，使用称为SuperScript III的反转录酶、USER酶、序列为TTTTUTTUTUTTTUTTTTUTTTUTTV的dTU-V cDNA合成引物、RNase H和RNase 1f。总的来说，这两种方法在过程中使用了类似的材料。它们都使用了100%和70%的乙醇、10 mM dNTP、AMPure ®、1.5毫升管磁力架珠粒和PCR仪。在这些方法中还使用了RNase抑制剂。它们是ANTI-RNAse抑制剂或RNAseOUT抑制剂。在cDNA测序中，科学家使用20 U/ mL末端转移酶、dATP、1 mM生物素-ddATP、10 mg/ mL牛血清白蛋白、Quant-tT™ OliGreen ® ssDNA试剂、NanoDrop 3300、HeliScope™单分子测序仪和Helicos ® 流式细胞仪
在开始分析短RNA之前，科学家必须了解实验的目标。必须将所需长度的sRNA与长RNA分离。他们必须明白，只有一部分sRNA具有可用于将sRNA转化为cDNA的mRNA的3'端polyA尾。此外，使用随机六聚体只能在某些情况下用于将短RNA转化为cDNA，因为RNA太短，无法顺利完成转化过程。一些RNA在其3'端和5'端具有修饰，这使得将它们转化为cDNA更加困难。检测sRNA有两种方法。第一种方法检测具有3'端-OH的sRNA。第二种检测3'端-polyA sRNA。首先，使用不同的试剂盒分离sRNA。如果只需要小于200nt的sRNA片段，那么mirVana试剂盒、miRNeasy或RNA/DNA试剂盒将很有用。TBEUrea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也可用于分离特定区域的sNRA。
分析sRNA的一般方法是通过在3'端添加polyC来修饰RNA。首先，他们将RNA放入含有30μL的PCR管中。此步骤中使用的短RNA量约为5ng至10ng。然后，他们在PCR仪中将试管在850C下孵育2分钟，然后将试管放入冰中孵育2分钟。向试管中加入10 mL的5×大肠杆菌PolyA聚合酶缓冲液；5 mL的25 mM MnCl2、1 mL的100 mM CTP、1 mL的Anti-RNAse或RNAseOUT，以及3 mL的2 U/ mL大肠杆菌PolyA聚合酶。因此，他们混合溶液并在PCR仪中在370C下孵育3小时。之后，在孵育的试管中加入40μL的水和10 μL的5M乙酸铵。然后，他们用苯酚、氯仿、异戊醇在试管中提取固体两次。当他们在-800C下向试管中加入三倍于100% EtOH时，溶液会发生沉淀。最后，他们将在40C下将溶液离心30分钟，并用70% EtOH洗涤沉淀物，然后真空干燥固体。最后，你必须将固体放入30.5μL的水中。为了制备cDNA，他们首先将1 mL的100 mM cDNA合成引物加入到上一步骤中得到的30.5μL溶液中。然后，他们将在PCR仪中在700C下将溶液孵育2分钟。在该温度下，他们将向溶液中添加更多试剂，如10 mL的5倍ThermoScript cDNA合成缓冲液、5 mL的0.1 M DTT、2.5 mL的10 mM dNTP和1 mL的ThermoScript反转录酶。最后，需要将溶液孵育15分钟以灭活反转录酶。在cDNA合成过程之后，他们会纯化cDNA。首先，他们将合成的cDNA与1 mL的RNase A混合。然后混合AMPure珠粒悬浮液，以确保珠粒不会悬浮。然后，在cDNA和RNase的混合物中，加入150 mL的AMPure珠粒，并在室温下孵育溶液30分钟。因此，他们使用磁力架收集珠粒，并从溶液中去除固体。用200 mL的70% EtOH清洗溶液两次，并在室温下干燥固体30到45分钟。然后，他们用20μL的水清洗cDNA两次。在开始分析短RNA之前，科学家必须了解实验的目标。必须将所需长度的sRNA与长RNA分离。他们必须明白，只有一部分sRNA具有可用于将sRNA转化为cDNA的mRNA的3'端polyA尾。此外，使用随机六聚体只能在某些情况下用于将短RNA转化为cDNA，因为RNA太短，无法顺利完成转化过程。一些RNA在其3'端和5'端具有修饰，这使得将它们转化为cDNA更加困难。
分析sRNA的第二种方法是通过分析带有polyA尾的RNA来制备cDNA。首先，将1 mL的50 mM dTU-V引物和1 mL的10 mM dNTP混合在一起。然后，使用热循环仪将溶液在650C下孵育5分钟。然后，将溶液放在冷铝板上，并放置1分钟。下一步是将溶液加入到2 mL的10倍SuperScript III反应缓冲液、4 mL的25 mM MgCl2、2 mL的0.1 M DTT、1 mL的SuperScript III和1 mL的RNAseOut中。将此混合物在850C下孵育50分钟。下一步是从之前获得的混合物中去除dTU-V引物序列。为了进行此反应，向混合物中加入1 mL的USER酶，并将溶液在370C下再次孵育15分钟。然后向溶液中加入d 1 mL的RNase H和1 mL的RNAse。此溶液可用于下一步，即纯化cDNA
在此反应中，将180μL的AMPure珠粒加热至室温。然后将珠粒添加到混合并孵育以制备cDNA溶液的溶液中。然后使用磁力架收集珠粒，并收集固体。然后用500 mL的70% EtOH清洗珠粒两次。然后固体会被干燥。最后，为了从珠粒中分离cDNA，向固体中加入20 mL的无核酸酶水。使用移液管去除液体，直到获得cDNA固体。
使用末端转移酶（TdT）通过polyA残基阻止cDNA的3'端。为了进行此过程，他们需要制备cDNA的3'端。首先，他们在10.8 mL的水中获得待尾部的cDNA（<10 ng）。然后，向混合物中加入2 mL的10×TdT缓冲液和2 mL的2.5 mM CoCl2，并将混合物在950C下孵育5分钟。向孵育的溶液中加入4 mL的50 mM dATP、0.2 mL的BSA和1 mL的TdT。然后，将混合物在PCR仪中在700C下孵育60分钟。将溶液放入冰中孵育2分钟。然后，向冷溶液中加入1 mL的10×TdT缓冲液、1 mL的2.5 mM CoCl2、0.5 mL的200 mM生物素-ddATP、6.5 mL的水和1 mL的TdT。最后，将在PCR仪中在700C下孵育20分钟