结构生物化学/单分子DNA测序
目前正在开发几种单分子DNA测序（SMDS）技术，但只有循环合成单分子测序目前已发展到可以直接从单个DNA分子中以大规模平行方式产生序列信息的程度。这种测序技术依赖于使用荧光标记的核苷酸，通过DNA聚合酶进入固定到表面的DNA互补链。单个DNA链被几微米隔开，可以作为独立实体进行监测。然后使用荧光显微镜依次检测每个掺入的标记核苷酸的荧光信号。由于每个DNA分子都是独立测序的，因此不同分子之间不需要同步。数千万个分子可以在单个小反应体积中平行测序，因此这种方法很容易以最低成本产生高通量测序。目前，该技术产生的读取长度较短，使其适合于参考序列已知的重新测序应用。单个参考基因组可以作为由短DNA片段产生的数千个基因组的模板。这些数据可用于以高精度、高速度和低成本查找多个目标环境中罕见的突变和遗传异质性。提取大量序列信息的能力将为癌症研究提供战胜各种遗传疾病所需的强大工具。
单分子测序是一个几乎二十年来一直被追求的目标，它可能是取代Sanger测序法的候选方法。循环合成DNA测序（SBS）不同于Sanger方法，Sanger方法依赖于根据链中最后一个碱基对具有特定颜色的扩增DNA链的长度进行分离。相反，在SBS中，合成本身随后采用各种方法，这些方法并行监测许多反应，从而加快测序速度并降低成本。在所有循环延伸方法中，单分子测序具有最高的序列信息密度，即单位面积的序列读取数。
目前的Sanger测序方法需要大量的DNA进行复制，然后每次测序运行都是在一条序列上进行的，这是一条漫长而昂贵的路线。循环合成DNA测序提供的替代方案是并行测序数百万个片段，而在循环合成SMDS中，根本不需要复制DNA。这种组合不仅会使全基因组测序便宜得多，而且会使其变得更快。这将允许对众多基因组进行快速测序，并生成有用的统计比较。
循环合成SMDS的基本方案如下
1）DNA被剪切成短片段
2）这些片段被一个共同的DNA尾部延长
3）DNA片段被固定到含有与共同DNA尾部匹配的引物的玻璃表面上。
4）所有结合的片段然后通过以下方式并行测序 -
4a）用荧光标记的核苷酸将一个碱基聚合酶延伸。
4b）通过TIRM检测多个视野，以记录数千万个DNA片段上的掺入事件。
4c）去除染料分子。
4d）用不同的核苷酸返回到4a。
5）将每个序列的数据与已知序列进行比较并与其对齐。
6）来自这种比对的数据分析揭示了目标DNA中的序列信息。
使用单分子荧光测序DNA需要仔细的实验设计，以便能够观察到单个核苷酸掺入DNA模板。目标是单独从每个分子中收集序列信息。由于对多个视野进行成像以同时监测数百万个模板上的掺入，因此应解决精确监测分子位置的技术。然后，应将每个分子的序列信息与参考序列进行比对。对于足够长的序列，即使存在分歧或“错误”，也可以将找到的序列与参考序列进行比对。“错误”可能来自测序中的真实错误，或者来自分析中的数据 - 即重新测序揭示的突变、多态性或异质性。为了获得足够的统计数据以提供有意义的DNA序列图像，需要过采样，这可以平均随机误差，并揭示样本的序列内容。由于同时测序的链数是巨大的，所以这不是该方法的严格限制。
循环合成SMDS是一种通过降低成本和提高通量来优于当前Sanger测序方法的技术。能够以非常高的密度和高数据速率并行测序数百万个碱基，而无需同步掺入的约束，使这种方法成为大规模DNA重新测序应用的可行选择。试剂使用的显著减少，加上最小的样品制备，有助于降低重新测序的成本和时间，以及几乎消除扩增偏差。这种方法的微流体实现可以进一步降低试剂和整个装置的成本。此外，在单分子荧光测序中使用Förster共振能量转移作为局部照明源，有助于减少核苷酸非特异性结合产生的噪声和假阳性信号，并且适用于其他需要严格限制的激发光的场合。使用可裂解荧光标记可以显着提高单分子测序中的读取长度，因为消除了相邻染料之间的空间位阻相互作用。通过优化反应条件和选择使用的DNA聚合酶，预计将进一步增加读取长度。
Hebert，Benedict和Ido Braslavsky。单分子荧光显微镜及其在循环合成单分子测序中的应用。http://www.phy.ohiou.edu/~braslavs/articles/Book_Chapter_Hebert_and_Braslavsky.pdf