结构生物化学/T4 DNA 连接酶

DNA 连接酶是一种特殊的连接酶，它可以通过创建磷酸二酯键将两条在互补链中都断裂的 DNA 链连接在一起。DNA 连接酶在 DNA 修复和 DNA 方面都有应用。此外，它在分子生物学实验室中被广泛用于遗传重组实验。DNA 连接酶是生成重组 DNA 序列的有用工具。例如，DNA 片段用限制性内切酶切割，然后用 DNA 连接酶重组。DNA 连接酶通常存在于大肠杆菌中。

T4 DNA 连接酶是一种由称为 T4 的噬菌体编码的酶。在 DNA 分子在 3'-羟基和 5'-磷酸末端连接在一起的反应中，连接酶被用作催化剂。鉴于修复反应中没有缺失的核苷酸，连接酶也可以催化 DNA 双链中两个片段的共价连接，形成一个不间断的链。为了实现这种催化活性，需要 ATP 和 Mg²⁺。缺少必需磷酸残基的 DNA 仍然可以通过用 T4 多核苷酸激酶磷酸化而连接。此外，连接酶还可以催化焦磷酸与 ATP 之间的磷酸交换反应。

来自大肠杆菌溶原菌 NM989 的 T4 DNA 连接酶的特征

T4 DNA 连接酶是一种单一多肽，分子量为 68,000 道尔顿。为了获得连接酶的最大活性，需要 pH 值为 7.5-8.0。在 pH 值分别为 6.9 和 8.3 时，该酶分别表现出其全部能力的 40% 和 65%。如前所述，Mg²⁺ 是 T4 DNA 连接酶发挥作用所必需的，而 Mg²⁺ 的最佳浓度为 10mM。巯基试剂 (DTT、2-巯基乙醇) 也是使用该酶所必需的。如果存在 NaCl，浓度超过 200 mM 将阻止所有酶促反应发生。对于分子间连接，特别是当底物 DNA 由大的 DNA 分子组成时，PEG（浓度为 1-10%）似乎会刺激酶活性。

应用

T4 DNA 连接酶主要用于将具有兼容粘性末端的 DNA 分子连接起来，或者将钝端双链 DNA 连接在一起，或连接到合成接头。涉及钝端 DNA 的反应比其他反应慢，但通过添加 150 至 200 mM NaCl 和低浓度的 PEG 可以加速连接速度。如果 DNA 中缺少 5' 磷酸，则在连接之前需要进行磷酸化。磷酸化是通过使用 T4 多核苷酸激酶与 ATP 实现的。如果要连接在一起的 DNA 片段具有彼此不兼容的突出的 5' 末端，则仍然可以通过使用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的克莱诺片段在受控反应中部分填充凹陷的 3' 末端来连接这两个片段。