结构生物化学/T4 多核苷酸激酶

描述

T4 多核苷酸激酶 (T4 PNK) 催化从 ATP 转移磷酸基团到单链和双链 DNA 和 RNA 以及寡核苷酸的 5'-OH 基团。该反应是可逆的。该酶也是一种 3'-磷酸酶和同源四聚体。它由四个 28.9 kDa 的相同亚基组成。T4 多核苷酸激酶可用于限制性内切酶的缓冲液中，用于 PCR 等技术。它可以在大肠杆菌中找到，具有噬菌体 T4 的重复基因。它也可以用于标记核酸的 5'-末端，这些末端可用作杂交探针、转录图谱；凝胶电泳的标记物。它们还可以用作 DNA 测序和 PCR 技术的引物，以及一种去除 3'-磷酸基团的酶。

存储

T4 多核苷酸激酶应储存在 -20°C。

应用

T4 多核苷酸激酶用于标记核酸的 5'-末端，标记后的产物可用于以下方式：- 凝胶电泳的标记物 - DNA 测序的引物 - PCR 的引物 - 杂交探针 - DNA 和 RNA 连接酶的底物 - 转录图谱的探针 寡核苷酸连接子和 DNA 或 RNA 的 5'-磷酸化是在连接反应进行之前所需的。使用 ³²P-后标记测定法，可以检测到 DNA 修饰。

其他

核酸的 5'-末端可以通过正向反应或交换反应进行标记。当进行正向反应时，[³²P 或 ³³P]-ATP 中的磷酸基团被转移到 DNA 或 RNA 的 5'-羟基末端。但是，如果核酸已经包含 5'磷酸基团，则可以通过使用小牛肠碱性磷酸酶或细菌碱性磷酸酶将其去除。当进行交换反应时，核酸 5'-磷酸基团被转移到 ADP，然后来自 [³²P 或 ³³P]-ATP 的放射性标记磷酸基团被转移到不含 5'-羟基的核酸。用于交换反应的理想缓冲液是咪唑-HCl 缓冲液，pH 值为 6.4。PEG 用于提高激酶反应的速度和效率，应添加到交换反应中。当存在磷酸根和铵离子时，T4 多核苷酸激酶会被抑制。在磷酸化反应之前，如果存在铵离子，则不应沉淀 DNA。