T4 RNA 连接酶通过形成 3'→5' 磷酸二酯键催化 5' 磷酸化末端的核酸供体与 3' 羟基化末端的核酸受体的连接，同时水解 ATP 生成 AMP 和 PPi。底物包括单链 RNA 和 DNA，以及二核苷酸焦磷酸酯。这种连接酶可由包含质粒 pRF-E35 的纯化的 E. coli 菌株 ER2497 形成。此酶用于用 5’-[32P] 标记 RNA 的 3' 末端。它作为 RNA 与 DNA 分子的分子内和分子间连接起作用。它还可以用于合成单链寡脱氧核糖核苷酸，并将额外的氨基酸结合到蛋白质中。