蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱法
介绍
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章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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引言
(Res1) 为了获得纯的蛋白质样品，必须将蛋白质与所有其他蛋白质和细胞成分分离。这可能是一项艰巨的任务，因为单个蛋白质通常只占细胞总蛋白质浓度的 1%。因此，在将其归类为纯净之前，必须去除样品中 99% 的蛋白质成分。同样具有挑战性的一项任务是保持蛋白质的活性形式。当我们纯化蛋白质时，我们将其从其自然环境中移除。因此，有必要模拟蛋白质通常存在的 pH 值、盐浓度和还原条件。在获得活性且纯净样品的过程中，我们希望尽量减少步骤数量，以便最大限度地提高分离结束时的产量。最后，由于蛋白质的制造意图是在短时间内发挥作用，因此尽快获得样品也至关重要。所有这些蛋白质分离组件都可以通过一组分离方法成功实现，这些方法统称为 色谱法。
蛋白质具有多种特性，可以利用这些特性来分离蛋白质。不同的色谱类型利用不同的特性。蛋白质可以通过以下方式分离
- 大小
- 形状
- 疏水性
- 对分子的亲和力
- 电荷
在本章中，将介绍和描述几种不同的色谱方法。虽然下面概述的方法都利用了蛋白质的不同特征来将蛋白质彼此分离，但它们都使用不溶性固定相和在固定相上流动的流动相。流动相通常是液体溶液。它包含我们想要分离的蛋白质。另一方面，固定相由一组珠子组成，通常基于碳水化合物或丙烯酰胺衍生物，这些珠子与离子带电物种、疏水性特征或亲和力配体结合。色谱成功的很大一部分与选择合适的固定相有关。
在 柱色谱法 中，当蛋白质样品被施加到色谱柱上时，它会在固定相和流动相之间平衡。根据色谱类型的不同，具有某些特征的蛋白质将与固定相结合，而缺乏所寻求特征的蛋白质将保留在流动相中并通过色谱柱。例如，在离子交换色谱中，带正电荷的蛋白质将与带负电荷的固定相结合，而带负电荷的蛋白质将与流动相一起从色谱柱中洗脱。最后一步包括通过引入一种与蛋白质在固定相上的结合位点竞争的颗粒，将蛋白质从固定相中置换出来，也称为洗脱。如今，各种商业化色谱柱 readily available，特别是 Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GE Healthcare 和 Omnifit 提供了各种色谱柱。
上面的图像是色谱图，它显示了基于检测器解释的信号的分离结果。
tm - 流动相穿过色谱柱整个长度所需的时间
tr - 特定蛋白质从色谱柱中洗脱所需的时间
资源
- Craig, P. 设计分离
- 佛罗里达州立大学，“色谱法” Michael Blaber 的生物化学实验室
- GE Healthcare - [1] - [2]
- BioPharm International Guide 色谱基础 (2003)。
- Bio-Rad 色谱蛋白质纯化 || 绿色荧光蛋白色谱试剂盒
- BioForum 色谱主题
- 色谱科学杂志
- M.Isabel Pedraza Mayer 色谱数据库
参考文献
- Harris, D.C. "Quantitative Chemical Analysis; 6th Edition", W.H. Freeman and Company: New York..
- Patrick McKay 色谱简介 Genentech, Inc. 恢复科学部高级研究助理 *。
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