蛋白质组学/蛋白质分离- 电泳/电泳简介

介绍

蛋白质分离 - 色谱法 电泳简介 蛋白质分离 - 离心 主题列表   蛋白质分离 - 离心

 

电泳简介

定义

电·泳·（ĭ-lĕk'trō-fə-rē'sĭs）n.
1) 带电胶体粒子或分子在施加电场（通常由浸入的电极提供）的作用下通过溶液的迁移。也称为电泳。
2) 一种分离物质（尤其是蛋白质）和分析分子结构的方法，基于每种成分在胶体悬浮液中在电场作用下的运动速度。

分·析·物 (a-nə-līt) n.
化学分析的化学物质。

电泳理论

电泳分离取决于离子或溶质在给定介质中在电场中迁移速度的差异。分析物的电泳迁移速度为

$v_{p}=\mu _{p}E$

其中 E 是电场强度，$\mu _{p}$ 是电泳迁移率。

电泳迁移率与缓冲液中的摩擦力成反比，与分析物的离子电荷成正比。分析物所受的摩擦力取决于分析物的尺寸和介质的粘度 (η)。当分析物通过缓冲液移动时，具有不同摩擦力或不同电荷的分析物会彼此分离。在给定的 pH 值下，分析物的电泳迁移率为

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r}}$

其中 r 是分析物的半径，z 是分析物的净电荷。

分析物电荷与尺寸比率的差异会导致电泳迁移率的差异。小而带高电荷的分析物具有更高的迁移率，而大而带低电荷的分析物具有更低的迁移率。电泳迁移率是分析物在给定介质中迁移速度的指标。作用在分析物上的净力是两种力的平衡：有利于运动的电力和不利于运动的摩擦力。在电泳过程中，这两种力保持稳定。因此，在给定的条件下，电泳迁移率对于给定的分析物是一个常数。

电泳的应用

电泳在蛋白质组学、法医学、分子生物学、遗传学、生物化学和微生物学中具有广泛的应用。

电泳最常见的用途之一是分析基因的差异表达。健康细胞和患病细胞可以通过其蛋白质的电泳模式差异来识别。蛋白质本身也可以通过这种方式进行表征，并且可以从凝胶中片段的质量推断出它们结构的一些信息。

存在许多不同的电泳类型，每种类型都可以用于不同的目的。例如，二维 (2-D) 电泳能够识别比大多数同类方法更多的蛋白质。本章将详细讨论这些方法中的许多方法。

参考文献

1. ^ 美国英语遗产词典，第四版。 http://www.bartleby.com/61/
2. ^ 梅里亚姆-韦伯斯特在线词典。 http://www.m-w.com
3. ^ Mans，Andreas 等。生物分析化学。帝国理工学院出版社，2004 年。
4. ^ Twyman，Richard。“二维聚丙烯酰胺凝胶电泳。” http://genome.wellcome.ac.uk/doc_wtd021045.html

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微流体电泳

蛋白质组学将从微流体中获得什么？

蛋白质组学对影响生物体行为的蛋白质及其功能的发现做出了重大贡献。最近的研究集中在它在单细胞和组织水平上探索蛋白质的作用，因为它们代表着每个人的指纹，特别是在疾病表现的方式方面。 由于单细胞或组织的样本量有限，因此在这些水平上研究蛋白质组对常规台式仪器来说是一个巨大的挑战。为了促进这种水平的研究，微流体技术被引入并发展成为蛋白质组学必不可少的工具。

除了能够处理少量样品外，微流体技术在微型化整个系统方面发挥着重要作用。结果，可以实现更好的性能，例如更少的材料消耗、更快的处理时间、更自动化和更低的成本。这种微尺度的另一个优势是样品和试剂之间的混合变得更加有效。 通常需要几个小时才能完成的某些化学过程可以在几分钟内完成。这种优势使基于微流体的免疫测定能够用于监测疾病的进展。 并且，随着成本的降低，微流体装置成为许多即时检测应用的理想选择。

微流体技术提供的最令人着迷的功能之一是它与其他系统（尤其是质谱仪）的高度集成能力。 各种检测的多路复用是另一个例子。这种多路复用潜力使基于微流体的设备成为（生物）化学和生物医学中的高通量解决方案。

微流体微系统中的电泳

将生物技术与微流体相结合使操作非常小的生物液体体积不仅可行，而且非常有效，尤其是在电泳方面。最近的研究和开发工作集中在发明一种完全自动化的电泳微系统，该系统易于根据特定需求定制，并提供与金标准一致的结果。这种微流体微系统通常被称为芯片实验室。在分析（生物）化学中使用的微流体微系统中，最广泛使用的方法来控制生物分子或分析物的运输是凝胶电泳或毛细管电泳。

尽管两种技术都利用了蛋白质、肽和 DNA 等生物分子在缓冲液中带电的特性，但微流控凝胶电泳在流体动力学方面与毛细管电泳有所不同。在微流控凝胶电泳中，多孔凝胶介质的存在阻止了微流控通道中的整体流动。^[3] 另一方面，在微流控毛细管电泳中，整体流动成为了影响分析物电动力学的工程因素，因为需要考虑电渗流的存在。^{[6] [7]} 从分析的角度来看，它们的电泳分离方法也有所不同。凝胶基电泳分离生物分子是基于大小或分子量的差异，而毛细管基电泳分离则是利用生物分子之间电荷与质量比的差异。

与金标准方法相比，微流控凝胶电泳和毛细管电泳获得的分析结果与传统的平板凝胶^[8] 和毛细管电泳^[5] 分别获得的结果一致。然而，在设计和应用的角度来看，这两种方法有一些优势和劣势需要考虑。在工程设计方面，微流控凝胶电泳系统更容易根据特定应用和多路复用进行定制，因为不需要考虑整体流动的影响。这使得将样本预处理等额外功能集成到微流控凝胶电泳中变得更加直接。^[3] 然而，由于毛细管基微系统不需要凝胶筛分介质，因此微流控毛细管电泳装置的可重复使用性远高于凝胶基对应物。在生物（分析）应用方面，微流控毛细管电泳有一个缺点，即它在分析电荷与质量比相似的带电粒子时表现不佳。^[3] 值得注意的是，一些微流控毛细管电泳系统能够与质谱仪直接连接。^[5]

本章将详细介绍微流控凝胶电泳和毛细管电泳的器件制造工艺、基本工作原理以及一些临床应用。尽管本章主要关注微流控电泳，但也包括了样本预处理、检测和定量过程等额外功能的集成。毫无疑问，这种集成是通过微流控技术实现的。

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微流控凝胶电泳

在凝胶电泳中利用微流控技术，在许多方面为蛋白质组研究提供了传统方法无法实现的优势。更快的处理时间、更灵敏的检测、更自动化的操作和高度集成的系统是使用微流控的主要优势。此外，微流控技术使凝胶电泳系统能够轻松地针对特定应用进行定制。例如，可以设计一个微流控凝胶电泳系统，使片外处理能够消除。事实上，它可以集成到基于微流控的系统中。样本制备的集成是一个切实可行的例子，它不仅简化了实验方案，而且提高了检测灵敏度。^[1]

本节专门介绍用于免疫测定的定制微流控凝胶电泳。^[3] 将详细讨论重要的方面，例如制造工艺、工作原理和临床应用。

一、制造工艺

凝胶电泳可以使用微流控技术针对特定的分析研究（例如免疫测定）进行定制。下面将介绍的微流控凝胶电泳免疫测定的定制制造工艺基于 Herr 等人使用的器件。^{[1] [3]} 在他们的研究中，抗体被用作报告物来检测特定蛋白质（作为抗原，可能是一种疾病生物标志物）的存在。下面将逐步介绍制造过程。

步骤 1：制造尺寸排阻膜^[3]

步骤 1：制造尺寸排阻膜

材料:

1. 脱气 22%（15.7:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（6% 双丙烯酰胺交联剂）
2. 0.2%（w/v）VA-086^[9]（光引发剂）
3. 1X Tris/甘氨酸缓冲液

微流控凝胶电泳免疫测定的第一个制造组件是尺寸排阻膜。该膜用于增强分析物浓度，从而提高检测灵敏度。利用聚丙烯酰胺凝胶制造该膜。其设计使得聚丙烯酰胺凝胶的孔径足够小，可以选择性地允许小于 10 kDa 的分析物分子通过。制造过程首先对玻璃基底进行图案化，以创建微流控通道和腔室。该过程使用常规的光刻和湿法蚀刻完成。在顶部玻璃盖上钻孔。然后，将玻璃基底和玻璃盖通过阳极键合粘合在一起。创建微流控结构后，将脱气 22%（15.7:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（6% 双丙烯酰胺交联剂）和 0.2%（w/v）VA-086 的溶液引入通道，如图所示。可以使用注射器将溶液加载到通道中。凝胶前体溶液静置约 30 分钟以平衡。

尺寸排阻膜采用激光光聚合制造。使用 355 纳米紫外激光片材在指定位置（如图所示）对聚丙烯酰胺凝胶进行图案化，以创建膜轮廓。将聚丙烯酰胺凝胶膜暴露在激光中直到聚合，大约需要 15 秒。将剩余的凝胶溶液抽走，然后用缓冲液冲洗通道进行清洗。

步骤 2：制造分离通道^[3]

步骤 2：制造分离通道

材料:

1. 脱气 8%（37.5:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（2.6% 双丙烯酰胺交联剂）
2. 0.2%（w/v）VA-086^[9]（光引发剂）
3. 1X Tris/甘氨酸缓冲液

制造尺寸排阻膜后，下一步是构建分离通道。该分离通道是蛋白质分离发生的地方。它包含一种中等孔径的聚丙烯酰胺凝胶。与膜一样，分离凝胶通过光聚合制造。为了制造分离通道，将分离凝胶前体溶液小心地用注射器加载到微流控通道中。凝胶溶液由脱气 8%（37.5:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（2.6% 双丙烯酰胺交联剂）、0.2%（w/v）VA-086 光引发剂和 1X Tris/甘氨酸缓冲液组成。凝胶加载方向由图中所示的箭头指示。凝胶加载到指定位置以定义分离通道。

凝胶均匀性是分析重复性的一个非常重要的因素。为了保证均匀性，膜分离侧的所有微流控通道必须在聚合前充满凝胶。因此，创建了一个凝胶塞，以防止在后续凝胶加载过程中凝胶泄漏。如图所示，凝胶塞通过光聚合制造，使得不需要聚合的区域受到暗场掩模的保护。通常，使用 100 瓦紫外光源进行光聚合过程大约需要 10 分钟。

File:UCEI Step 3.png

步骤 3：制造加载通道^[3]

步骤 3：制造加载通道

材料:

1. 脱气 3.5%（37.5:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（2.6% 双丙烯酰胺交联剂）
2. 0.2%（w/v）VA-086^[9]（光引发剂）
3. 1X Tris/甘氨酸缓冲液

在这一步中，膜分离侧剩余的微流控通道（没有凝胶）小心地充满凝胶前体溶液，如图中所示的箭头指示。该溶液包含脱气 3.5%（37.5:1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（2.6% 双丙烯酰胺交联剂）、0.2%（w/v）VA-086 光引发剂和 1X Tris/甘氨酸缓冲液。该凝胶溶液将生成具有大孔径的聚丙烯酰胺凝胶，并定义加载通道。

分离通道和加载通道都充满凝胶后，整个微流控装置暴露在紫外线下 15 分钟。结果，分离凝胶和加载凝胶聚合，分别定义了分离通道和加载通道。现在，该微流控装置可以使用了。

完整的微流控凝胶电泳装置^[3]

完整的微流控装置

图示显示了制造后的完整微流控凝胶电泳装置。该装置包含三种不同孔径的聚丙烯酰胺凝胶。孔径最大的凝胶用于加载通道，以通过防止整体流动促进样本和试剂的电泳。孔径中等大小的凝胶用于分离通道以进行蛋白质分离。最后，孔径最小的凝胶用作尺寸排阻膜，用于富集过程。有关其功能的详细说明将在题为工作原理的部分中介绍。

在设备设计中，所有加载通道都连接到加载区域，加载区域是在开始时（阳极键合之前）钻出的孔。样品和试剂被装载到那里。此外，一些孔被用作废液收集的储液器。这些是电流流向的地方。值得注意的是，除了是加载区域外，它们还用作电极的插入点，电极连接到可编程供电电压源。

不使用时，此微流控凝胶电泳装置必须保持浸没在缓冲液中并储存在 4°C。

二、工作原理

基于带电分子电动力学传输的相同原理，微流控凝胶电泳与常规平板凝胶电泳的工作原理类似，但处理速度更快，检测灵敏度更高，系统高度自动化集成。在本节中，将使用上一节中描述的微流体结构讨论微流控凝胶电泳的基本操作。

待讨论的微流控凝胶电泳系统由包含微流控通道/储液器、电源和荧光检测系统的结构组成。用于运输分析物的通道和储液器设计为充满大孔径聚丙烯酰胺凝胶。这种大孔径凝胶通过阻止体积流动来促进分析物的电动力学传输。 电源设计为可编程。可以立即分配一对电极及其极性。这提供了对微流体环境中才能实现的电动力学过程的更好控制。荧光检测功能也集成到系统中。它用于检测目标分析物并量化其浓度。

在本节中，将逐步讨论操作步骤，包括每个步骤背后的原理，假设目标分析物带负电。请注意，讨论将主要集中在免疫测定应用上，该应用更普遍地适用于 Herr 等人的研究。 系统可以进行少量修改以用于其他应用。

电动力学加载荧光标记的报告器

加载已知浓度的报告器

作为免疫测定研究的工具，使用特定于特定目标蛋白质的报告器。抗体可以作为检测所研究的蛋白质或抗原的报告器，就像对目标蛋白质具有高亲和力的受体一样。为了一般性，在本节中将使用术语“报告器”。

要开始使用该设备，需要用缓冲液填充微流体通道。然后，将已知浓度的报告器溶液与样品溶液一起加载到指定的储液器中。通常对于微流体装置，每次分析所需的体积约为几十微升。为了检测和量化，报告器通常用荧光标签标记。检测和量化方法将在后面详细讨论。

加载荧光标记的报告器后，激活连接到报告器和样品废液储液器的一对电极，如示意图所示。然后在两个电极之间施加电势。当报告器分子在缓冲液中带电时，它们会以电动力学的方式向样品废液储液器移动，如红色箭头所示。但是，报告器分子被尺寸排阻膜阻挡，该膜仅允许尺寸小于 10 kDa 的颗粒通过。在此加载步骤中，只有离子缓冲液可以穿透膜。在第一次电泳结束时，越来越多的荧光标记的报告器分子在凝胶侧的膜上聚集，如插图所示。

电动力学加载样品

加载包含目标分析物的样品

下一个过程是以电动力学的方式加载样品以与已在膜上聚集的报告器结合。与报告器一样，分析物分子在缓冲液中带电。要开始电泳，连接到报告器储液器的电极被停用。连接到样品储液器的电极被打开。这两个电极之间的电势导致样品中蛋白质的带电分子以电动力学的方式向样品废液储液器移动，如红色箭头所示。

一旦分析物的带电分子到达膜，一些尺寸小于 10 kDa 的分子会穿过膜并被收集到样品废液储液器中。只有更大的分子，包括目标蛋白质，会留在膜的凝胶侧，如插图所示。此过程有助于提高分析物的浓度，提高报告器与目标蛋白质之间结合的概率。然而，非目标蛋白质也会变得更加集中，并可能导致信噪比水平降低。使用具有高结合特异性的报告器可以缓解此问题。值得注意的是，微流控凝胶电泳免疫测定的灵敏度和动态范围取决于这种富集过程。

需要精心设计，以便电泳持续足够长的时间，以便更多的报告器和目标蛋白质结合在一起。通常，所用报告器的浓度远高于目标蛋白质的浓度。因此，所有目标蛋白质分子更有可能被报告器分子检测到。在第二次电泳结束时，报告器及其复合物，包括剩余的非目标蛋白质，会留在膜的凝胶侧。

切换电极以避免在电泳分离过程中通过膜运行电流

避免在分离过程中通过膜运行电流

据报道，当通过膜运行电流时，凝胶电泳分离会出现不可重复的结果。 因此，有必要避免在分离过程中，尤其是在分离过程中，在膜上施加电势。一种可能的解决方案是编程电源，以便在目标分析物进入分离凝胶之前切换电极。该图显示了满足此要求的切换过程。

根据该图，电势最初施加在膜上，只是为了将分析物从膜上运输。在分析物进入分离凝胶之前，左上角缓冲液储液器的电极被停用。同时，右上角缓冲液储液器上的一个具有相同极性的新电极被打开。可以看出，带负电的分析物的流动保持在相同的路线，朝向缓冲液废液储液器移动。

值得注意的是，还有其他电极组合也可以用于执行此步骤。概念是简单地不允许在分离步骤期间在膜上进行电泳。在第三次电泳结束时，所有带电分子都已准备好进行凝胶电泳分离。

未结合报告器及其复合物的电泳分离，可通过激光诱导荧光检测

凝胶分离

在此步骤中，报告器分子及其复合物通过凝胶电泳分离。该过程通过电动力学的方式将带电分子带入分离凝胶中。由于报告器分子及其复合物具有相似的荷质比，因此这两种物质之间的分离仅基于其分子量 (MW) 的差异。值得注意的是，所有非目标蛋白质都不会在此免疫测定中进行研究。只有报告器分子及其复合物处于检查中。

由于报告器分子用荧光染料标记，因此可以使用单点激光来诱导荧光。这种激光诱导荧光 (LIF) 由检测器监测，该检测器将检测未结合报告器及其复合物的存在，然后将检测到的荧光强度与两种物质的浓度相关联。该荧光检测系统放置在分离通道的缓冲液废液储液器附近。检测和量化概念将在下面描述。

荧光检测、电泳图和凝胶状图

荧光检测和结果

单点激光诱导荧光 (LIF) 是一种用于检测和量化报告器分子及其复合物的平均方法。当分子穿过激光束时，附着的染料会发出荧光，其强度由检测器测量。然后，检测器生成与测量强度相对应的电泳图。电泳图峰下的面积可以与目标蛋白质的浓度相关联。

未结合的报告器可以通过以下事实与其复合物区分开来：未结合的报告器分子的分子量 (MW) 低于其复合物。因此，未结合的报告器分子在分离凝胶中以电动力学的方式更快地移动，并首先被检测到。相应的强度在电泳图中给出第一个峰。

在配体和受体单对的情况下，电泳图中通常会有两个峰。通常，第一个峰属于分子量较小的受体或报告器，其次是对应于分子量较大的配体-受体复合物的第二个峰。此信息也可以用计算机生成的凝胶状图表示。在凝胶状图中，最上面的条带代表首先到达的未结合报告器分子。条带的亮度传达有关检测到的荧光强度程度的信息。条带的宽度对应于峰的宽度，它传达有关分析物迁移时间的信息。

值得一提的是，受体和配体之间的结合概率是免疫测定灵敏度和准确性的一个重要因素。因此，富集过程在提高这种概率方面起着重要作用。为了增强这种富集过程，已经证明对样品进行预处理（片外）或增加电泳样品加载时间段是有效的。

三、临床应用

一项临床应用报道了这种微流控凝胶电泳装置在辅助口腔诊断中的应用。^[1][3] 它被用于牙周病的早期诊断，以及监测疾病状态及其从人唾液中的发展。牙周病或牙周炎是一种推定的口腔疾病，它会破坏胶原蛋白，导致主要组织损伤、结缔组织附着丧失和骨质流失。在牙周炎患者唾液中发现基质金属蛋白酶-8 (MMP-8)、白介素-1β (IL-1B) 和 C 端端肽吡啶啉交联 (ICTP)。这些蛋白质被鉴定为疾病生物标志物，并成为检测和监测这种口腔疾病的目标蛋白质。^[1] Herr 等人展示了使用这种微流控凝胶电泳装置检测和定量 MMP-8。

在他们的研究中，针对 MMP-8 的单克隆抗体被用作报告分子，它具有仅与唾液中的 MMP-8 结合的特异性。使用这种单克隆抗体 ($a$MMP-8) 具有一个优势，即它消除了对匹配对抗原抗体的需求。在报告分子混合物中，还添加了牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白标准作为参考。两者 ($a$MMP-8* 和 BSA*) 为了检测目的而被荧光标记。请注意，星号用于表示荧光标记的分析物。根据他们的研究，混合物中使用了 1 nM 的 ($a$MMP-8*) 和 1 nM 的 BSA*。

在微流控装置中，($a$MMP-8*) 仅与 MMP-8 生物标志物结合，形成一个具有相似电荷质量比的复合物。未结合的抗体及其复合物根据其大小的差异通过分离凝胶相互分离，并如微流控凝胶电泳的工作原理所述，分别检测到。在这种免疫测定应用中，具有最高迁移率的 BSA* 首先被检测到，其次是剩余的 ($a$MMP-8*) 和 MMP-8 复合物。相应的峰值显示在电泳图和凝胶状图中。使用凝胶状图中的峰面积或谱带宽度来计算 MMP-8 的浓度。

为了能够量化从患者收集的唾液样本中内源性 MMP-8 的浓度，首先需要生成校准曲线。校准曲线是从已知 MMP-8 浓度的分析中获得的。通过在健康患者的稀释唾液中添加已知浓度的重组 MMP-8，然后进行微流控凝胶电泳，进行了一系列实验。从电泳图中，将 MMP-8 复合物的峰面积与 BSA* 的峰面积进行归一化，然后绘制成对应浓度的函数。使用四参数逻辑模型^[3] 的非线性最小二乘拟合方法用于获得校准曲线。基于此校准曲线，根据其归一化峰面积预测内源性 MMP-8 复合物的浓度。据报道，健康受试者和患病受试者中 MMP-8 的平均浓度分别为 64.6 +/- 16.4 ng/mL 和 623.8 +/- 204.0 ng/mL。^[3] 值得注意的是，被归类为牙周病的患者中 MMP-8 的浓度反映了该疾病的动态活性。

通过与从常规酶联免疫吸附测定 (ELISA) 获得的结果进行比较，验证了从微流控凝胶电泳获得的结果的有效性。正如 Herr 等人报道的那样，从微流控装置获得的结果与来自 ELISA 的结果高度相关，r² = 0.979，其中 r 是皮尔逊积矩相关系数。然而，这种基于微流控的免疫测定与常规对应物相比具有几个优势，因为它绕过了 ELISA 所需的耗时反应和洗涤步骤，更加自动化，仅需要单一抗体，使其适用于更广泛的应用，并且每次分析所需的唾液样本量更少。此外，它不需要抗体的表面固定。

除了测量牙周炎患者 MMP-8 的浓度外，还进行了临床检查，以将分析数据与生理症状相关联。发现 MMP-8 与骨骼和组织丢失高度相关，但与探查时出血无关。通过对 MMP-8 生物标志物的高度灵敏检测，这种基于微流控的免疫测定可以提供早期诊断，从而改善该疾病的临床治疗。此外，使用 MMP-8 抑制剂来减少胶原蛋白降解，这种微流控凝胶电泳装置可以用于监测和跟踪 MMP-8 抑制剂治疗的进展。

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微流控毛细管电泳

在本节中，将介绍另一种类型的微流控电泳。与微流控凝胶电泳不同，微流控毛细管电泳基于本体流的电动现象原理。分析物的电荷质量比的差异是毛细管微流控通道中电泳分离的根本原因。由于不需要筛分介质，微流控毛细管电泳在制造和可重复使用方面比其凝胶对应物更有利。本文将详细描述该装置的详细制造过程和工作原理，包括其临床应用。请注意，以下解释的制造过程和工作原理基于 Backofen 等人 2002 年发表的论文。^[10]

一、制造工艺

使用 PDMS 制造微流控结构比使用玻璃更容易且成本更低。该过程从创建用于模制 PDMS 的模具开始，可以通过对光刻胶进行图案化来获得。显影后，将 PDMS 和交联剂的混合物倒在图案化的光刻胶上，然后固化。将 PDMS 剥离并切割，以创建通往储液器的通道。最后，将这种图案化的 PDMS 永久地附着在玻璃基座上，即可使用。以下是分步详细过程。

描述使用负性光刻胶和标准光刻技术创建用于 PDMS 模制的模具的示意图^[10]

创建用于 PDMS 模制的模具

材料：^[10]

1. 光掩膜
2. 4 英寸硅片
3. SU-8 50 负性光刻胶
4. 丙二醇甲醚醋酸酯显影剂

首先从准备过程开始，创建光掩膜。使用的光掩膜通常是接触式光掩膜，可以由玻璃制成，或者简单地是印刷了设计的微流控结构布局的透明材料。光掩膜用于将这种微流控图案转移到光刻胶上，光刻胶被旋涂到硅片上。值得注意的是，使用的光刻胶的选择会影响光掩膜的设计。例如，如果使用负性光刻胶，则所有微流控图案都需要使用明场进行设计，以便紫外线能够透过并聚合负性光刻胶的接触区域。未曝光区域将在显影剂中被洗掉。另一方面，设计图案是正性光刻胶的光掩膜的暗场。

在涂覆光刻胶之前，需要先清洁硅片。标准 RCA 清洗过程适用。然后，将负性光刻胶旋涂到硅片上并进行预烘烤。在紫外线照射下，涂覆的负性光刻胶根据光掩膜上设计的微流控布局进行图案化。然后对曝光的光刻胶进行后烘烤和显影。结果，如图所示，只有负性光刻胶的曝光区域保留了下来。^[10]

显示使用显影的图案化光刻胶进行 PDMS 模制的示意图^[10]

模制 PDMS 以制造微流控结构

材料：^[10]

1. PDMS 低聚物
2. Sylgard 184 交联剂

准备用于 PDMS 模制的模具后，准备 PDMS 和交联剂的混合物。聚合物和交联剂的比例为 10:1。^[10] 然后将脱气的混合物倒在晶片上，以覆盖整个光刻胶模具。最后，将模制的 PDMS 在 70 °C 的烘箱中固化 1 小时。^[10] 该步骤总结在示意图中。此外，还提供了在晶片上模制的 PDMS 的横截面图。

固化后，将 PDMS 从晶片上剥离。将具有转移的微流控结构的 PDMS 进一步处理，为每个圆形储液器区域创建开口。这个开口将用于加载样品或试剂，以及施加真空和压力的地方，真空和压力由注射器调节。

显示完整的微流控毛细管电泳装置的示意图^[10]

完成微流控毛细管电泳装置

材料:

1. 玻璃板
2. 针式探头

一块带有涂层图案电极的玻璃板用于封闭微流体通道和储液池，同时为储液池中的流体提供电气连接。 电极可以通过铬和铂的蒸发在玻璃基板上制造。 铬用作玻璃基板和铂电极之间的粘合层。 金属图案可以通过常规光刻工艺实现，该工艺需要另一个光掩模（透明体）来在玻璃上形成电极。 值得注意的是，最终的微流体毛细管电泳系统中使用了图案电极和针探针的组合，如示意图所示。 铂针探针用于为电泳提供高电势，同时用作电化学传感器。

PDMS 通过等离子体氧化永久附着在玻璃板上。 氧原子和硅原子之间的共价键 (O-Si-O) 在两种材料之间提供永久密封。 完成的微流体毛细管电泳装置如示意图所示。

二、工作原理

一般来说，微流体毛细管电泳装置的操作可以通过三个基本步骤来描述——加载样品/试剂、形成样品塞和电泳分离。 此处描述的加载过程涉及使用注射器手动加载以调节流速。 加载完所有样品和试剂后，形成样品塞。 此步骤需要仔细设计，因为分析物的浓度依赖于此步骤。 在最后一步中，分析物通过电泳分离。 与（微流体）凝胶电泳中的尺寸分离不同，（微流体）毛细管电泳的分离是基于分析物电荷与质量比的差异。

值得注意的是，这里讨论的微流体毛细管电泳系统用作分析平台，所有样品预处理步骤都在芯片外进行。 以下描述主要集中于样品中带负电荷分析物的分析。 请注意，以下描述的操作原理部分基于 Backofen 等人 2002 年发表的文章。^[10]

所有微流体通道均通过手动填充并通过电泳平衡^[10]

加载过程

系统设置从用缓冲液和预处理的样品溶液加载微流体储液池开始，这样除了样品储液池之外的所有储液池都包含缓冲液。 继续用缓冲液填充微流体通道，将注射器连接到储液池的顶部开口，并用于调节流速。 应用真空和压力直到通道充满缓冲液。

下一个过程是通过电泳平衡样品和缓冲液。 为此，将高压电源连接到系统，如示意图所示。 一种可能的配置是使用多个电源装置，例如两个 U1 = 0.5 kV 装置和一个 U2 = 1.2 kV 装置。 此过程允许缓冲液和样品在通道中定位，如示意图所示。

样品溶液流过小的连接通道并进入通向缓冲液和缓冲液废液储液池的通道^[10]

形成样品塞

为了分析样品，需要将样品的预定义和可控部分注入分离通道。 样品的这种预定义和可控部分称为样品塞。 根据所讨论的微流体结构，样品塞是由样品溶液的流体动力学流动形成的，这是由于储液池中溶液液位的差异造成的。 这种流体动力学流动仅在所有高压电源关闭时才会发生。

如示意图所示，部分样品溶液流过小的连接通道，进入通向缓冲液和缓冲液废液储液池的通道。 此部分样品可以分成两个端口，分别用蓝色和黄色虚线轮廓表示，如插图所示。 蓝色轮廓是样品塞，其体积可以通过设计指定。 黄色虚线轮廓表示当重新开启高压电源时会流回样品废液储液池的部分样品。

样品塞沿分离通道电动力学地移动到缓冲液废液储液池^[10]

电泳分离

当打开所有高压电源时，带负电荷的分析物分子和缓冲液离子开始通过电泳再次流动。 在小的连接通道处，部分样品溶液开始分成两部分，然后向相反方向移动。 如插图所示，用蓝色虚线轮廓表示的部分样品溶液，即样品塞，沿分离通道电动力学地移动到缓冲液废液储液池。 另一方面，用黄色虚线轮廓表示的部分样品溶液通过电动力学地移动到样品废液储液池。 然后，小的连接通道会像最初那样被缓冲液填充。

在分离通道中，样品塞中的带负电荷的分析物由于它们的电荷与质量比的差异而被分离。 每个分析物都由放置在末端缓冲液废液储液池的电化学传感器检测。 对于此微流体毛细管电泳系统中使用的电化学传感器，每个分析物的检测是基于针探针和参比电极之间的电压降的降低。 这些电压降可以在电泳图中绘制，并可用于研究样品溶液中的分析物成分，例如蛋白质或肽。

三、临床应用

Guzman 等人 2008 年报道的皮肤病变患者生物标志物的检测和定量^[5] 是微流体毛细管电泳的临床应用之一。 基于前面描述的相同基本原理，他们的研究中使用了更复杂设计的微流体毛细管电泳，称为免疫亲和毛细管电泳 (IACE)。 IACE 是一种芯片实验室，它利用微流体技术在一个芯片上整合了基于亲和性的纯化、富集和电泳分离过程。

在针对这种炎症性疾病的生物标志物的临床研究中，IACE 用于分析来自不同皮肤损伤阶段患者的微解剖样本。 十二种不同的抗体用于捕获被认为是生物标志物的十二种相应的靶蛋白/肽。 这种亲和力结合也有助于从微流体环境中分离靶分析物和非靶分析物，从而改善后续的富集过程并减少分析过程中的背景噪声。 据报道，集成的富集功能提高了灵敏度并增强了 IACE 的低检测限。 可以检测和定量的浓度低至每毫升几纳克。 据报道，凭借这种高度灵敏的能力，IACE 可用于监测疾病的进展模式。 IACE 获得的结果被证明与传统的组织病理学等金标准一致。

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参考文献

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