蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱法

介绍

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章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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引言

高效液相色谱 (HPLC)

(Res1) 为了获得纯的蛋白质样品，必须从所有其他蛋白质和细胞成分中分离出蛋白质。这可能是一项艰巨的任务，因为单个蛋白质通常只占细胞总蛋白质浓度的 1%。因此，在样品被归类为纯净之前，必须去除 99% 的蛋白质成分。同样具有挑战性的任务是保持蛋白质的活性形式。当我们纯化蛋白质时，我们将它们从其天然环境中移除。因此，有必要模拟它们通常所处的 pH 值、盐浓度和还原条件。在获得活性且纯净的样品的过程中，我们希望最大限度地减少步骤数量，以最大限度地提高分离结束时的产量。最后，由于蛋白质是为仅在短时间内发挥作用而制造的，因此尽快获得样品也至关重要。所有这些蛋白质分离组件都可以通过一组统称为色谱法的分离方法成功实现。

有几种可以利用的蛋白质特性来分离蛋白质。不同的色谱类型利用不同的特性。蛋白质可以根据以下标准进行分离：

• 大小
• 形状
• 疏水性
• 对分子的亲和力
• 电荷

典型色谱柱

   在本章中，将介绍和描述几种不同的色谱方法。虽然下面概述的方法都使用蛋白质的不同特征将蛋白质彼此分离，但它们都利用不溶性固定相和流过它的流动相。流动相通常是液体溶液。它包含我们要分离的蛋白质。另一方面，固定相由一组珠子组成，通常基于碳水化合物或丙烯酰胺衍生物，这些珠子与离子带电物种、疏水特性或亲和配体结合。色谱法的很大一部分成功与适当固定相的选择有关。

   在柱色谱法中，当将蛋白质样品施加到色谱柱时，它会在固定相和流动相之间达到平衡。根据色谱法的类型，具有某些特征的蛋白质将与固定相结合，而缺少所寻求特征的蛋白质将保留在流动相中并通过色谱柱。例如，在离子交换色谱法中，带正电荷的蛋白质将与带负电荷的固定相结合，而带负电荷的蛋白质将与流动相一起从色谱柱中洗脱。最后一步涉及通过引入一个与蛋白质在固定相上的结合位点竞争的粒子来从固定相中置换蛋白质，也称为洗脱。如今，各种商业色谱柱唾手可得，尤其是Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GE Healthcare 和Omnifit 提供了各种色谱柱。

上图是色谱图，它显示了根据检测器解释的信号进行分离的结果。

t_m - 流动相流过色谱柱的整个长度所需的时间

t_r - 特定蛋白质从色谱柱中洗脱所需的时间

资源

1. Craig, P. 设计分离
2. 佛罗里达州立大学，“色谱法” Michael Blaber 的生物化学实验室
3. GE Healthcare - [1] - [2]
4. BioPharm International Guide 色谱法基础 (2003)。
5. Bio-Rad 色谱法蛋白质纯化 || 绿色荧光蛋白色谱法试剂盒
6. BioForum 色谱法主题
7. 色谱科学杂志
8. M. Isabel Pedraza Mayer 色谱法数据库

参考文献

1. Harris, D.C. "Quantitative Chemical Analysis; 6th Edition", W.H. Freeman and Company: New York..
2. Patrick McKay 色谱法简介 Genentech, Inc. 回收科学部高级研究员 *。

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