蛋白质组学/蛋白质 - 蛋白质相互作用/交联
本节
交联是两个聚合物链之间形成的离子键或共价键。在生物科学的背景下，交联通常是指连接两个分子单元以研究其相互作用的分子反应。
在研究蛋白质-蛋白质相互作用的过程中，交联技术已被证明在获取有关蛋白质结构和功能的信息方面非常重要。交联也有助于阐明有关受体、信号级联和多蛋白复合物中蛋白质相互作用的关键信息[1][2]。从交联实验中获得的信息非常强大，因为它提供了更高分辨率的结构数据；可以将蛋白质-蛋白质相互作用映射到特定的氨基酸或结构域。交联最重要的优势在于它允许捕获非共价蛋白质-蛋白质相互作用，这些相互作用是瞬时的或依赖于特定的生理条件，并将其捕获在长期共价复合物中，即使在进一步处理（包括纯化、富集和分析）过程中也能保留这些信息[3]。
双功能交联试剂包含两个反应性基团，因此可以创建一种方法来共价连接两个目标基团。这些目标基团可以在同一个蛋白质上，也可以在不同的蛋白质上。这些试剂的常用目标是亲核侧链，如酪氨酸或半胱氨酸。
在同双功能交联试剂中，两个反应性基团相同。大多数同双功能交联试剂会产生分子内交联。
在异双功能交联试剂中，反应性基团不同。这允许分子间交联。拥有不同的反应性基团使交联剂能够在不同分子上的特定官能团之间进行偶联，并有助于最小化自身偶联。
| 亚胺酯 | 亚胺酯交联剂与伯胺反应生成酰胺键。所得到的酰胺被质子化，因此在生理 pH 下带正电荷。亚胺酯同双功能交联剂可以穿过细胞膜，这使得它们在交联膜内的蛋白质以及进行分子内交联以研究蛋白质亚基结构方面具有优势。 |  |
| NHS 酯 | NHS 酯与蛋白质的 N 末端存在的 α-胺基团和赖氨酸残基上的 ε-胺基团反应形成酰胺键。在反应过程中形成共价酰胺键，释放 N-羟基琥珀酰亚胺。NHS 酯交联反应最常在磷酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐或硼酸盐缓冲液中进行。与分子表面伯胺反应的 NHS 酯交联剂会导致蛋白质构象发生改变，从而可能导致生物活性丧失。 |  |
| 马来酰亚胺 | 当反应 pH 值在 6.5 到 7.5 之间时，马来酰亚胺基团特异性地与巯基反应。形成的硫醚键是稳定的，并且不可逆。 | |
| 卤乙酰基 | 最常用的 α-卤乙酰交联剂包含碘乙酰基，它在生理 pH 下与巯基反应。碘乙酰基与巯基的反应通过用硫醇取代碘来进行，生成稳定的硫醚键。 |  |
氧化交联是由 Brown 等人引入的 [4]，它具有高度特异性。该过程由 Ni(II)-肽试剂 [N(II)-NH2-Gly-Gly-His-COOH] 和过酸的存在（如过氧邻苯二甲酸镁或oxone）介导 [5]。该机制的引发涉及过酸将 Ni(II) 氧化为 Ni(III)，从而产生高价氧物种。反过来，该物种随后可以从芳香族氨基酸侧链（如酪氨酸残基）中剥夺电子。这个自由基阳离子随后可以通过亲电攻击共价偶联到附近的酪氨酸或半胱氨酸。最后，氢原子被未知物种抽象。最终产物是交联的蛋白质复合物。要了解首次描述的完整机制，请参阅 Brown 等人[4]。
这种交联方法的优势在于，通过亲和交联策略，可以将 Ni(II)-肽选择性地递送至蛋白质，并在添加过酸时以所需的时间进行激活。反过来，这种反应可能高度局限，并且避免对无关蛋白质进行修饰，从而使数据解释不那么复杂。
交联是研究蛋白质-蛋白质反应的有用工具，但大多数交联方法的性质阻碍了它们在活细胞中的应用。最近，使用光敏氨基酸类似物在相互作用的蛋白质之间创建交联，使科学家能够在体内研究蛋白质复合物。含有光敏重氮环的亮氨酸和蛋氨酸类似物都被喂给生长的细胞。这些类似物被整合到蛋白质中，并在暴露于紫外线下时在相互作用的蛋白质之间创建交联[6]。
光敏剂（如天然存在的核黄素）在暴露于光线下会发生光激发，将能量转移到反应中。光激发的分子通常也具有很高的反应活性，通常会容易地与附近的化合物结合。该特性已被用于治疗角膜圆锥症（一种角膜退行性疾病）的新型临床疗法。将核黄素溶液添加到眼睛中，并用紫外线激活。反应性的核黄素在角膜上创建新的交联键，恢复其部分机械强度[7]。
用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的氨基酸类似物利用了光激发分子的反应活性。这些类似物与天然氨基酸相同，除了一个光敏重氮环。当暴露于紫外线下时，氮会被释放，并形成一个反应性卡宾。活化的卡宾的半衰期非常短，因此反应必须与非常接近的基团发生。在蛋白质复合物中，卡宾将与附近的基团反应形成稳定的交联键，将复合物“冻结”在其当前位置，使科学家能够分析复合物内的蛋白质-蛋白质相互作用。
细胞在含有这些类似物的培养基中生长，细胞在合成过程中将它们整合到蛋白质中，这些蛋白质通常存在于相应的天然氨基酸的位置。产生了三种氨基酸类似物。光亮氨酸和光蛋氨酸大量生产，而光异亮氨酸的产量几乎少 20 倍。
这些氨基酸类似物的令人兴奋之处在于它们没有毒性。研究表明，光氨基酸可以很好地整合到细胞中，在缺乏天然亮氨酸和蛋氨酸但富含光类似物的培养基中培养细胞，只会略微减缓生长，但细胞活力保持不变。此外，细胞的光活化不会影响活力。这使得这些氨基酸类似物可以在生长中的细胞中用于研究体内蛋白质-蛋白质相互作用，对细胞的影响最小[8]。
光激发重氮丙烷已整合到糖中以分析膜反应。具有重氮丙烷的单糖被整合到细胞表面，用紫外光激发，然后作为膜内糖蛋白复合物的组成部分进行分析。这些光糖在代谢上整合到细胞的糖蛋白中，可以捕获糖蛋白之间的相互作用。由于重氮丙烷体积小，糖蛋白的功能相对不受影响[9]。
- ↑ Lynch 和 DE Koshland Jr. 大肠杆菌天冬氨酸感觉受体跨膜区的二硫键交联研究。美国国家科学院院刊，第 88 卷，10402-10406。
- ↑ A. Fancy，Karsten Melcher，Stephen Albert Johnston 和 Thomas Kodadek。化学与生物学。1996 年 7 月，3:551-559。用于研究多蛋白复合物的新化学：六组氨酸标签作为蛋白质交联试剂的受体。
- ↑ A. Trakselis，Stephen C. Alley 和 Faoud T. Ishmael。通过交联、裂解和蛋白质组学的结合鉴定和绘制蛋白质-蛋白质相互作用。生物偶联化学。第 16 卷，第 4 期，第 741-750 页。
- ↑ a b C. Brown，Sang-Hwa Yang 和 Thomas Kodadek。由镍肽复合物介导的蛋白质高度特异性氧化交联。生物化学 1995，34，4733-4739。
- ↑ A. Fancy。使用化学交联或标记转移技术阐明蛋白质-蛋白质相互作用。化学生物学最新观点。第 4 卷，第 1 期，2000 年 2 月 1 日，第 28-33 页。
- ↑ (2008 年 3 月 20 日)。在维基百科，自由的百科全书中。2008 年 3 月 30 日 14:59 检索。
- ↑ (2008 年 3 月 19 日)。在维基百科，自由的百科全书中。2008 年 3 月 30 日 15:20 检索。
- ↑ M.，Radzikowska，A. 和 Thiele，C. (2005) 光亮氨酸和光蛋氨酸允许在活细胞中鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。自然方法。2，261 – 268
- ↑ Tanaka 和 Jennifer J. Kohler。用于捕获糖蛋白相互作用的光活化交联糖。美国化学会志；2008；130(11) pp 3278 – 3279
作者：Anthony Corbett，Joshua Horn