蛋白质组学/蛋白质 - 蛋白质相互作用/实验
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本节
荧光共振能量转移 (FRET) 使用荧光能量转移来可视化蛋白质相互作用。该过程很简单。将荧光团融合到目标蛋白，然后用激发波长照射。第一个荧光团将它从光源吸收的一些能量转移到第二个荧光团，第二个荧光团反过来将它的一些能量发射到环境中，在那里，使用荧光显微镜，它变得可见。
生物发光共振能量转移 (BRET) 是一种生物检测系统，它利用供体和受体之间的能量转移来可视化结合。当两个分子彼此靠近时，受体上的绿色荧光蛋白会吸收附着在供体上的荧光素酶的能量。结果，GFP 发射的光在肉眼看来是绿色的。
酵母双杂交系统是一个体内系统，它利用基因的结合域 (BD) 和激活域 (AD) (用于转录) 来确定蛋白质相互作用。蛋白质融合到报告基因的 BD 和 AD，每个都一个。当连接到 BD 的蛋白质与融合到 AD 的蛋白质相互作用时，转录启动，报告基因被转录。通过测量报告基因表达的水平，可以量化这种效应。
由于 DNA 微阵列技术的成功，科学的其他领域正在开发阵列或“芯片”来一次性测试多个事物。其中一个领域是蛋白质相互作用研究，其中阵列技术目前价格昂贵且复杂，但看起来很快就会成为一个现实的选择。蛋白质相互作用阵列的优势在于让科学家能够快速便捷地测试众多相互作用。阅读第 8 章中有关阵列的更多信息：蛋白质芯片。
要执行 TAP，必须将“TAP 标签”连接到目标蛋白。这是通过目标蛋白与标签的基因重组来完成的，通常使用质粒。表达的融合蛋白然后包含与标签共价结合的目标蛋白。该标签由来自金黄色葡萄球菌的蛋白 A 的两个 IgG 结合域和一个钙调蛋白结合蛋白 (CBP) 组成，它们之间有一个 TEV 蛋白酶切割位点。CBP 最靠近蛋白，IgG 结合域最远。当蛋白从细胞中提取时，任何相互作用蛋白都会随之而来，给你的是与标签连接的蛋白复合物，而不仅仅是你的一种蛋白。将样品应用于 IgG 珠柱，使目标复合物由于蛋白 A 而与之结合，而任何其他蛋白都会通过。通过 TEV 蛋白酶切割释放结合的蛋白，并将得到的蛋白通过含钙调蛋白珠的柱子。CBP 使它们与这些珠子结合，蛋白酶和其他任何污染物都会通过。这将导致目标蛋白及其相互作用伙伴的非常纯净的样品。得到的蛋白可以通过 SDS-PAGE 或质谱法鉴定。
与许多相互作用检测方法不同，固相检测不涉及蛋白的标记。在这些技术中，一种蛋白连接到换能器的表面。另一种蛋白包含在可以应用于表面的溶液中。这使得能够实时研究反应的结合动力学。一些常见的方法使用表面等离子共振或反射干涉来检测和成像相互作用。与蛋白芯片趋势一样，这一领域正朝着对几个相互作用进行平行分析的方向发展。这可以通过微流控系统来完成，其中溶液中的蛋白通过在连接有不同类型蛋白的多个表面上运行的小通道。
研究蛋白质相互作用的一些最新和最令人兴奋的发展涉及单个分子。这些允许以低浓度进行实验，并且使用定义良好的样品，因此不会有其他相互作用混淆结果。
一种使用的方法是力谱。相互作用蛋白对中的一员连接到原子力显微镜的尖端，该显微镜可以测量非常小的力。另一个蛋白连接到固体表面。将尖端降至表面，使蛋白相互作用，然后拉开。将尖端从表面拉开所需的力就是相互作用力。Nevo 等人使用这种方法有效地确定了效应蛋白与受体的结合是否会导致构象变化[1]。
此外，可以使用荧光来检测单个相互作用的蛋白对。两种蛋白可以用不同的荧光标签标记，并使用共聚焦显微镜扫描样品的小体积的非常薄的部分并检测荧光。当它检测到两种颜色时，它就知道它一定找到了相互作用的配对，因为它们必须非常靠近才能位于同一薄部分。
- FRET: http://biowww.net/browse-44.html
- BRET (BMG Lab 网站): http://www.bmglabtech.com/
- 酵母双杂交：http://www.uib.no/aasland/two-hybrid.html
[1] Nevo, R.，Brumfeld, V.，Elbaum, M.，Hinterdorfer, P.，Reich Z. 2004. 通过单分子力测量直接区分蛋白质激活模型。 生物物理学杂志，87:2630-2634.
[2] Piehler, J. 2005. 在体内和体外测量蛋白质相互作用的新方法。 结构生物学最新观点，15:4-14.
[3] Puig, O.，Caspary, F.，Rigaut, G.，Rutz, B.，Bouveret, E.，Bragado-Nilsson, E.，Wilm, M.，Se´raphin, B. 2001. 串联亲和纯化 (TAP) 方法：蛋白质复合物纯化的通用程序。 方法，24:218-229.
[4] http://physics.nist.gov/Divisions/Div844/facilities/smspec/smspec.html