蛋白质组学/蛋白质芯片/分析
分析
在蛋白质芯片分析领域，目前科学家们正在努力克服这项技术的边缘实验中遇到的几个障碍。科学家们面临的几个主要挑战包括：动态蛋白质浓度、几乎压倒性的独特蛋白质数量以及为每种蛋白质创建特异性探针。
动态蛋白质浓度指的是，一个细胞中任何给定蛋白质的确切数量可能与同一个细胞中另一种蛋白质的确切数量大不相同。事实上，目前估计，最低表达水平和最高表达水平的蛋白质数量之间的差异约为 1012 个数量级。换句话说，最稀有蛋白质和最丰富蛋白质之间的差异可以达到百万亿倍。
为了进一步使动态蛋白质浓度问题复杂化，任何给定蛋白质的确切数量将根据所考虑的细胞类型而波动。当然，有一些蛋白质，称为 管家蛋白，在每个细胞中都高度表达。这些蛋白质是细胞存活的基本结构和功能所必需的。除了管家蛋白外，不同组织的细胞往往具有不同的蛋白质浓度分布。例如，在心脏组织中高浓度表达的蛋白质很可能在肝脏组织中以不同的浓度表达。因此，在一种细胞类型中检测蛋白质的方法可能不适用于另一种细胞类型。
不幸的是，科学家们往往对那些稀少且浓度低的蛋白质感兴趣。为了克服这一限制，一种设计的方法是去除丰富的蛋白质。通常，只有极少数蛋白质以大量存在。通过去除这些蛋白质，科学家可以减少最低表达蛋白质和最高表达蛋白质之间的数量级差异。但是，蛋白质纯化 可以是一个非常费力且耗时的过程，许多科学家认识到，运行几个蛋白质芯片实验可能更为明智，每个实验分析不同的蛋白质浓度范围。 1
另一个巨大的挑战在于为每种蛋白质确定特异性探针。目前，解决这个问题的一种尝试是设计特异性抗体。过去，抗体是通过动物免疫产生的。然而，这种方法的通量不足以被认为适合蛋白质芯片实验设计。相反，正在开发方法以创建抗体库。 1 下面列出了来自 Molecular Station 的一些示例。
- 噬菌体抗体展示
- 核糖体展示
- SELEX (通过指数富集进行配体的系统进化)
- mRNA 展示
- Affibody 展示
通过创建结合特定蛋白质组而不是特定蛋白质的抗体，可以缩小抗体方法的范围。除了使用抗体外，还有适体，即短寡核苷酸，它们更容易创建，但可能难以选择针对特定蛋白质。 1
为了分析蛋白质芯片的结果，有必要确定与捕获剂（用于分析芯片）结合的蛋白质的类型或数量，或蛋白质发生的相互作用次数（用于功能芯片）。蛋白质芯片的分析可以分为两类：标记和无标记。蛋白质芯片的分析可能是一个困难且棘手的过程。已经开发出许多直观的
这种类型的分析涉及使用放射性或荧光进行标记。 2 标记可以直接连接到蛋白质或捕获剂（例如酶或底物）上，并立即检测到。标记也可以连接到不同的分子（例如抗体、抗原或底物）上，这些分子作为第二步被洗过芯片。这可以防止标记改变所研究蛋白质的构象。
然而，标记的蛋白质芯片存在几个问题。尽管存在防止标记改变蛋白质构象的方法，但蛋白质相互作用干扰的可能性仍然存在。 1 标记对结合特性的影响，以及对缺乏可重复性的倾向 1，构成了几个重大问题，这些问题可以被视为使用无标记方法的充分理由。
ELISA 测定是检测抗原或蛋白质的有用工具。使用特异性抗体靶向所需的抗原或蛋白质。由抗体-抗原结合形成的复合物被另一种识别此类复合物的抗体结合。后一种抗体连接到一种酶上，因此“酶联”是首字母缩略词 ELISA 的一部分。抗原的结合通常会触发可以观察和限定或量化的反应。
可以在 此处 找到正负 ELISA 反应的非常有用的动画。
ELISA 测定可能有用，但它们不幸地容易出现假阳性，因为许多非特异性蛋白质-抗体相互作用可能发生。 1
夹心免疫测定是 ELISA 测定的一个版本，它使用荧光标记抗体作为探针，并使用激光扫描来收集数据。 2
同位素标记涉及使用放射性同位素标记的分析物作为探针，并使用 X 射线胶片来收集数据。 2 附加不寻常的同位素提供了识别特定标记所需的信息，在本例中为蛋白质。
含有这些同位素的分子可以通过质谱法或红外光谱法区分。 3 存在各种同位素，每个同位素都有不同的质量，因此导致了质谱法的使用。红外光谱法可以使用，因为各种同位素具有不同的振动模式。
平面波导使用荧光标记的抗体作为探针，并使用电荷耦合器件（CCD）收集数据。 2 波导 通常涉及电磁波的检测。术语“平面”仅仅指的是系统几何形状类似于平面。
平面波导可能提供实时分析系统令人兴奋的能力，从而能够研究蛋白质相互作用动力学。 1
电化学检测涉及使用金属耦合分析物作为探针，并使用电导率测量来收集数据。 2
与 DNA 微阵列一样，使用荧光标记的蛋白质芯片实验以具有不同强度的斑点图像的形式提供数据。然后使用类似于用于 DNA 微阵列分析的软件包分析这些图像。执行的分析类型的两个示例是斑点强度的量化以及对照和实验条件之间强度的比较。
用于分析标记蛋白质芯片的软件包包括
- 蛋白质微阵列分析工具 (ProMAT) 是一款免费提供的软件包，用于评估斑点的强度。ProMAT 由太平洋西北国家实验室开发。
- ZeptoVIEW PRO 是一款来自 Zeptosens 的商业软件包，它允许对斑点强度进行量化，并与他们的蛋白质芯片一起使用。
这种类型的分析利用了蛋白质的特性，包括质谱法、表面等离子体共振 (SPR) 和原子力显微镜 (AFM)。 2
某些芯片，例如 Ciphergen 的 ProteinChips，可以与 MALDI-TOF 质谱仪耦合。 2 通过使用 SELDI 质谱法可以获得更高的分辨率。 2 数据收集和分析与在蛋白质分离技术（例如液相色谱）后进行的质谱法相同。
表面等离子体共振是在将偏振光照射到专门设计的蛋白质芯片上时产生的光学效应。 2 该芯片需要包含一层薄金属膜，这将导致光线折射。 2 折射角取决于结合到芯片上的分子的质量，因此具有结合的底物的蛋白质将导致光线以不同于没有底物的蛋白质的角折射。 2 不同的角度可以通过光电二极管阵列测量。 2 此外，表面等离子体共振可以与质谱法耦合，用于使用从芯片表面进行的微量回收进行蛋白质鉴定。 2
表面等离子体共振能够提供实时分析。这样带来的结果是，可以研究蛋白质相互作用的动力学。检测分辨率是本页之前讨论的一个挑战，它代表了 SPR 分析的一个缺点。平面波导可以提供具有更高检测分辨率的实时分析。 1
原子力显微镜 (AFM)
[编辑 | 编辑源代码]原子力显微镜使用表面形貌的变化来检测蛋白质相互作用。 2 它是高分辨率技术，数据以地形图的形式收集。 4
1. 蛋白质微阵列芯片。2005-6。分子站。（访问）2006 年 4 月 1 日 <http://www.molecularstation.com/protein-microarrays/>。
2. Twyman R.M. 蛋白质组学原理；BIOS 科学出版社：牛津，英国，2004 年；第 9 章。
3. “同位素标记”。维基百科，自由的百科全书。2007 年 2 月 5 日，UTC 03:19。维基媒体基金会，Inc. 2007 年 4 月 9 日 <http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Isotopic_labeling&oldid=105717372>。
4. 原子力显微镜 - 戴维斯心脏肺研究所以。 http://heartlung.osu.edu/6161.cfm （访问日期：2006 年 5 月 20 日）。
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