蛋白质组学/蛋白质样品制备/电泳样品制备
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)，在 第 4.2 章 中详细描述，是一个通过分子量分离分子（通常是蛋白质）的过程。假设蛋白质在凝胶基质中的迁移速度与其质量直接相关，即蛋白质的总物质，那么确保蛋白质的形状不影响其速度至关重要。因此，已经改进了一些样品制备技术，为样品中的所有蛋白质赋予相似的形状。此外，还改进了协议以最大限度地提高与质量相关的特性的一致性。本节旨在说明在为凝胶电泳制备样品过程中涉及的多种技术的用途和程序。
十二烷基硫酸钠 (SDS) 是一种阴离子去污剂，用于在凝胶电泳之前使蛋白质变性。如上所述，必须使样品中的所有蛋白质变性，以便仅根据其在凝胶基质中的质量来分离它们。SDS 有效地分解了 α-螺旋和 β-折叠（都主要由氢键组成）以及许多三级结构。但是，SDS 不会分解参与许多三级结构的任何二硫键；通常需要用 DTT 处理，如以下所述，来分解二硫键。
SDS 在二维电泳 (2DE) 中被发现特别有用。正如 第 4.2 章 中提到的，2DE 涉及一个初始的等电聚焦 (IEF) 阶段，该阶段导致所有蛋白质在其等电点 (pI) 上找到其等电点 (pI)，导致所有蛋白质的净电荷为零。由于 PAGE 的性质，需要负电荷来诱导蛋白质通过凝胶基质的运动。幸运的是，用 SDS 处理蛋白质样品不仅使样品中的所有蛋白质变性，而且还结合所有蛋白质并将负电荷赋予结合的蛋白质。人们发现 SDS 以与该蛋白质质量成正比的方式结合蛋白质，这会导致与蛋白质质量直接相关的负电荷；进一步支持仅基于质量的分离。
二硫苏糖醇 (DTT) 是一种还原剂，通常用于分解二硫键，这些二硫键有助于 SDS 无法影响的三级结构，从而进一步使蛋白质变性，以弱化蛋白质形状在 PAGE 中的作用。DTT 通过两个连续的硫醇-二硫键交换反应还原二硫键，导致 DTT 变成一个六元环结构。另一种二硫键还原剂 2-巯基乙醇 (ME) 通常代替 DTT 使用。此外，应该注意的是，虽然 DTT 和 ME 都可以有效地减少蛋白质中的二硫键，但它们有重新形成的趋势。因此，蛋白质样品通常用 2-碘乙酰胺处理，这是一种烷基化硫醇试剂，它与游离硫醇共价结合并阻止二硫键重新形成。
- 二硫苏糖醇 (DTT)
- 2-巯基乙醇 (ME)
为了从酵母中提取蛋白质，将收集的酵母细胞重新悬浮在含有 NaOH、2-巯基乙醇和 SDS 的缓冲液中，并立即加热至 90oC。然后用 Tris-HCl 缓冲液中和样品。然后添加甘油和溴酚蓝，以便最终样品包含在标准 SDS-PAGE 缓冲液中。热量和缓冲液的结合实际上破坏了所有细胞壁，同时使需要提取的蛋白质可溶。
改变 SDS 的浓度、沸腾时间以及添加增溶试剂可以改变和优化酵母蛋白质的提取。发现向上述方案中添加脱氧胆酸盐或尿素可以优化某些蛋白质的提取，但会降低其他蛋白质的优化。上述参数对于提取 S. cerevisiae 中表达的大多数蛋白质是最佳的，但并非所有蛋白质都是如此。迄今为止，还没有一种通用的缓冲液或方案可以从酵母细胞中产生所有表达的蛋白质。
von der Haar T PLoS One 2(10):1-8 (2007)
主要关注点
本文的主要关注点是找到酵母蛋白质的最佳提取技术。von der Haar 小组已经找到了针对大多数酵母蛋白质的最佳技术，但并非所有表达的蛋白质都是如此。
摘要
任何蛋白质的发表文章中得出的丰度数据可能因研究组而异。这是因为他们使用的提取程序的效率不同。von der Haar 小组已经找到了一个可以提取酵母S. cerevisiae 中大多数蛋白质的蛋白质提取程序。他们发现的最佳原始方案要求使用 0.1N NaOH 作为重新悬浮缓冲液，孵育几分钟，然后在标准 SDS-PAGE 样品缓冲液中沸腾。该程序的问题是，当酵母在 0.1N NaOH 中悬浮和孵育时，并非所有细胞壁都被破坏。许多酵母细胞仍然是完整的。这可能导致酵母细胞表达在研究环境下通常不表达的蛋白质，而是由于 NaOH 环境而表达。von der Haar 小组已经设计了一种新的方案来解决这个问题。
新的方案要求提取的酵母细胞重新悬浮在含有 NaOH、2-巯基乙醇和 SDS 的缓冲液中，并立即加热至 90oC。然后用 Tris-HCl 缓冲液中和样品，然后添加甘油和溴酚蓝，以便最终样品包含在标准 SDS-PAGE 缓冲液中。热量和新缓冲液的结合实际上破坏了所有细胞壁，同时使需要提取的蛋白质可溶。
von der Haar 小组还发现，改变 SDS 的浓度、沸腾时间以及添加增溶试剂可以改变蛋白质提取的优化。他们发现的最佳 SDS 浓度为 2%。最佳沸腾时间为 90oC 下 10 分钟。这些参数对于提取S. cerevisiae 中表达的大多数蛋白质是最佳的，但并非所有蛋白质都是如此。添加 1% 脱氧胆酸盐提高了 Sup45p 和 Rpl25p 的提取效率，但降低了 Sup35p 的提取效率。添加 8M 尿素提高了 Sup35p 的提取效率，但降低了所有其他蛋白质的提取效率。
Haal 小组确实找到了提取 S. cerevisiae 中表达的大多数蛋白质的最佳方案，但并非所有蛋白质都是如此。添加其他增溶剂可能对某些蛋白质是最佳的，但会显着降低其他蛋白质的溶解度。很明显，没有一种通用的缓冲液或方案可以从酵母细胞中产生所有表达的蛋白质。
有关更详细的步骤，请参见文章中的图 1。
新术语
- 蛋白质组
- 在给定环境条件下，由生物体遗传物质表达的一组蛋白质（http://www.answers.com/topic/proteome-2）
- 细胞密度
- 每单位体积的细胞数（http://www.oilgae.com/ref/glos/cell_density.html）
- YPD（酵母蛋白胨葡萄糖）
- 培养基含有蛋白胨、葡萄糖和其他用于生长S. cerevisiae 的物质（http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&catalog_id=630409&page=all）
- 稳定期
- 也称为 G0 期，是对营养缺乏或饥饿的反应。酵母细胞可以通过改变其结构和代谢来延长其寿命。（http://www.rose.brandeis.edu/PRLab/projects/yeast/yeast.html）
- 碱性裂解
- 使用 NaOH 打开细胞以分离 DNA 或蛋白质的方案（http://bitesizebio.com/2007/11/07/the-basics-how-alkaline-lysis-works/）
课程相关性
- 在蛋白质组学课程中，我们学习了如何通过质谱或凝胶电泳等实验来定量分析特定条件下的蛋白质表达。但为了正确分析表达的蛋白质，必须有一种技术能够提取大部分，如果不是全部的蛋白质。本文介绍了专门针对酵母提取蛋白质的最佳方法。
弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Gottschling实验室
http://labs.fhcrc.org/gottschling/Yeast%20Protocols/pprep.html (03/29/09)
主要关注点
该网站主要提供Gottschling实验室的方案和其他信息，该实验室专注于癌症研究。
摘要
Gottschling实验室对研究酵母，特别是S. cerevisiae，很感兴趣，因为它们与癌症有关。当酵母细胞进入其生命周期的中晚期时，它们会经历基因组不稳定。这种基因组不稳定也可能出现在人类身上，因为年龄增长和癌症。Gottschling小组认为，酵母所经历的转变与人类年龄增长和癌症发生率增加之间存在联系。
该网站提供了许多不同的方案，以及提取酵母蛋白质的方案。他们列出了三种不同的方法，用于制备用于直接凝胶电泳的酵母蛋白质。第一种方法使用SUMEB缓冲液和蛋白酶抑制剂来提取酵母蛋白质。该网站提供了制备SUMEB缓冲液所需的成分。第二种方案仅使用样品缓冲液，该网站还提供了样品缓冲液的配方。他们列出的第三种方案是使用玻璃珠和样品缓冲液。
请参阅网站链接，以获取有关快速蛋白质制备步骤的更详细说明。
课程相关性
- 在蛋白质组学课程中，我们学习了如何通过质谱或凝胶电泳等实验来定量分析特定条件下的蛋白质表达。但为了正确分析表达的蛋白质，必须有一种技术能够提取大部分，如果不是全部的蛋白质。该网站提供了多种不同的方案，用于提取酵母蛋白质作为凝胶电泳的样品。