蛋白质组学/蛋白质样品制备/色谱样品制备
对于高效液相色谱（HPLC），重要的是样品溶液（流动相）必须不含颗粒物质。由于 HPLC 色谱柱的灵敏性和涉及的极端压力，此类污染物可能造成极大的损害，因此污染物去除非常重要。每种特定的液相色谱技术都需要专门的溶液。反相色谱需要极性有机溶剂，而正相色谱可以使用无机溶剂，例如水。最常用的有机溶剂之一是乙腈。这种极性赋予溶剂从反相色谱柱中洗脱蛋白质的能力，并且也很容易与质谱联用。此外，溶液缓冲液必须含有高质量的 pH 稳定剂，例如乙酸（酸）和乙酸钠（碱）。氯化钾等盐缓冲液用于在离子交换色谱中产生洗脱条件，并且也必须具有非常高的纯度。下面列出了常见的色谱试剂
- 缓冲剂
- 乙酸
- 磷酸
- 三乙胺
- 乙酸钠
- 醋酸铵
- 磷酸钾
- 碳酸氢钠
- 氯化钠
RIPA 是放射免疫沉淀法，该缓冲液可用于溶解细胞中的蛋白质。分析表明，RIPA 溶解了一些膜结合蛋白和大多数细胞内蛋白。RIPA 不适用于寻找蛋白质-蛋白质相互作用，因为该缓冲液会破坏蛋白质-蛋白质形成的键。
亲和色谱是一种蛋白质分离技术，其中对特定蛋白质具有亲和力的底物用于色谱柱的固相中。一种高度特异的技术是使用重组技术来分离从重组 DNA 表达的蛋白质。如果将一个基因插入克隆载体以用于发酵大量蛋白质，则可以改变该基因以在蛋白质中包含额外的氨基酸。然后可以将此子序列用作固定相底物的结合位点。这方面的两个例子是组氨酸残基的添加，它们与某些金属离子共价结合，以及谷胱甘肽 S-转移酶[1] 蛋白的添加，它将与谷胱甘肽结合。
http://en.wikipedia.org/wiki/Affinity_chromatography
包含寡组氨酸结构域的细菌表达多肽的单步纯化。 基因。1992 年 2 月 1 日；111（1）：99-104。
具有酶活性的谷胱甘肽 S-转移酶（pGEX）融合蛋白的溶解和纯化。 分析生物化学。1993 年 4 月；210（1）：179-87。
Ngoka, Lambert CM；蛋白质组学科学6：30. 第 1-21 页；在线发表 2008 年
本文的重点是使用广泛建立的 RIPA 方法从癌细胞中制备蛋白质样品。RIPA 缓冲液通过将蛋白质从其天然不溶状态溶解成可分离的样品来实现这一点。它还将蛋白质与盐和其他污染物分离，使其成为可靠的样品制备工具。只使用一种样品缓冲液的问题在于缓冲液可能没有溶解来自样品细胞的所有蛋白质。除了 RIPA 之外，该实验还使用尿素来提取 RIPA 遗漏的蛋白质。具有不同起源特征的肿瘤细胞接受了 RIPA 分析和尿素分析。结果表明，使用不同的方法，每个细胞都产生了一些相同的蛋白质和许多独特的蛋白质。在 RIPA 分析中，许多细胞内蛋白和小分子量蛋白很容易溶解。其他一些蛋白质会弱地结合到缓冲液中，然后才溶解。尿素分析的结果有些相反，该测试将溶解细胞外基质蛋白和高分子量蛋白。这并不是说两种蛋白质没有产生相同的结果，从论文中可以看出，使用不同的分析方法发现的相同蛋白质之间存在很大的重叠。在制作蛋白质样品或寻找新蛋白质时，实验者应该使用多种分离技术来获得尽可能多的蛋白质种群。
新词
血浆生成激活剂 - 用于解离血凝块的分子。
血管生成 - 血管的发生和进展。（dictionary.com）
在蛋白质组学的提取过程中，使用多种提取缓冲液来获得不同的蛋白质库是有用的。
摘要
免疫沉淀包含多个步骤，第一步是裂解细胞并获得蛋白质混合物。然后最好清理细胞中所有非特异性蛋白质。在完成此清理后，您需要添加抗体以沉淀目标。然后，您可以分离您的样品以进行进一步分析。一些裂解缓冲液是 RIPA 和 NP-40，RIPA 会破坏蛋白质-蛋白质相互作用，而 NP-40 用于识别蛋白质-蛋白质相互作用。该技术的成功取决于蛋白质-抗体形成的亲和结合。
免疫沉淀是一种蛋白质提取方法，通常用放射性标记，该技术可以获得蛋白质样品的分子量和数量。使用抗体-蛋白质复合物提取样品。免疫沉淀还可用于确定蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质合成速率以及浓缩少量蛋白质。
新词
预清理 - 免疫沉淀中降低非特异性蛋白质的步骤。
单克隆抗体 - 克隆的抗体，可产生大量自身种群。（dictionary.com）
免疫沉淀广泛应用于蛋白质样品制备，它可产生浓度适宜且准确靶向特定蛋白质的样品。