蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱法/反相
章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改人：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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反相色谱法是一种基于蛋白质溶解度的分离方法。术语“反相”源于其前身“正相”色谱法，后者使用极性固定相，例如二氧化硅。在反相色谱法中，固定相填充了用含有非极性烷基（通常为 C8 或 C18）的硅醚改性的二氧化硅。这创造了一个疏水固定相。另一方面，流动相含有相对极性的有机溶剂，例如甲醇、丁醇、异丙醇、乙腈(Ref1)。
使用这些极性溶剂会给蛋白质带来非常苛刻的条件，因此该方法通常适用于更小、更稳定的蛋白质。所有肽和蛋白质都携带亲水性和疏水性氨基酸的混合物，但那些具有高净疏水性的蛋白质将能够与固定相进行疏水性相互作用。当蛋白质混合物应用于色谱柱时，极性蛋白质将首先洗脱，而非极性蛋白质将结合到色谱柱上。可以通过增加有机溶剂的浓度来洗脱结合的疏水蛋白，这会增加特定组分的保留时间。反相色谱法通常与质谱法结合使用，以量化从色谱柱洗脱的蛋白质(Res1)。
反相色谱法的步骤与离子交换色谱法中的步骤非常相似。同样，该过程可以概括为四个步骤(Res2)
- 平衡
- 样品应用
- 洗脱
- 再生
在此步骤中，疏水色谱柱通过应用特定的样品缓冲液进行预处理。由于色谱柱是疏水的，水分子往往在色谱柱和缓冲液之间的连接处排列整齐。
在此步骤中，将样品蛋白质注入系统。混合物中具有高百分比暴露疏水性氨基酸残基的蛋白质将吸附到疏水性固定相上。混合物中的其他蛋白质将被洗掉。
该过程的这一阶段涉及改变缓冲液条件以洗脱结合的疏水蛋白。最常用的方法是使用梯度，该梯度使用有机缓冲液逐渐增加疏水性。蛋白质解吸的顺序通常与其每个蛋白质具有的外部疏水残基数量相关（Res 3）。
此阶段涉及从固定相上洗掉任何残留的蛋白质，并将条件恢复到过程开始时的状态。这涉及创造一个不太疏水的环境。
这是一个 80 分钟反相分离运行的样品图，达到 70% 有机溶剂水平，具有三个洗脱峰。
请注意此图中的梯度延迟。延迟是所有液相色谱梯度的常见现象，它是由软件指示梯度开始泵送以及溶剂到达色谱柱的延迟造成的。还要注意有机溶剂浓度并非从 0% 开始。这是因为结合的碳氢化合物在没有少量有机溶剂的情况下，在结合其他疏水分子方面效率要低得多。
优化
为了看到更大的峰分离，您可以再次运行相同的蛋白质更短的时间，或者降低有机溶剂的最大量。使用上面的图，似乎最后一个蛋白质在约 50% 的有机溶剂浓度下洗脱。考虑到延迟，最后一个峰洗脱，并且调整了 40% 的有机溶剂浓度。然后可以进行新的分离，使用 40% 的最大有机溶剂浓度，这将产生更多分离的峰。
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