放射肿瘤学/放射生物学/DNA损伤

首页： 放射肿瘤学 | RTOG 试验 | 随机试验

辐射诱导的 DNA 损伤

DNA 作为辐射靶标

多条证据表明 DNA 损伤是细胞死亡的关键因素
- 微辐射研究表明，如果只照射细胞质，杀死一个细胞需要更高的剂量，而如果照射细胞核则需要更高的剂量
- 短程发射同位素（例如 I-125）在直接掺入 DNA 时会产生有效的杀伤效果
- 单链 DNA 断裂的发生率不会导致细胞死亡，而双链断裂和染色体畸变的发生率与细胞死亡密切相关
- 胸腺嘧啶类似物（IUdR、BrUdR）掺入染色质后会改变放射敏感性
然而，有一些证据表明辐射对细胞膜的损伤也可能很重要，可能引发细胞凋亡
最后，也有一些证据表明存在“旁观者效应”，即对于每一个被 RT 微靶向的受损细胞，周围 80-100 个细胞也会死亡或显示出受损迹象

DNA 结构

碱基：氮、氧和碳的环。腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶。通过氢键与对面的 DNA 链结合
核苷：碱基 + 脱氧核糖
核苷酸：碱基 + 脱氧核糖 + 磷酸基团
主链：交替的糖（脱氧核糖）和磷酸基团
单链：核苷酸序列
双链：通过氢键结合在一起的两条互补链
染色体：一条单个 dsDNA 的整个长度；一个细胞中存在多条染色体。由着丝粒和两条臂组成，但在正常情况下，它们并不像这样可见
染色质：dsDNA 和蛋白质的复合物，半紧密包装，在间期存在于细胞核中。每条染色体以染色质形式存在，便于包装，并便于 DNA 转录和修复的访问
染色单体：在细胞分裂过程中合成后，构成染色体的两个相同 DNA 拷贝之一。紧密包装。只要染色单体通过着丝粒保持接触，就使用该术语。此后，它们被称为子染色体

DNA 损伤概述

辐射可能损伤 DNA 的任何组成部分
- 碱基损伤
- 单链断裂 (SSB)
- 双链断裂 (DSB)
- DNA 链交联
- DNA-蛋白质交联
紫外线辐射 (UV-A) 通常会导致碱基损伤，如 8-oxo-G 和嘧啶二聚体（例如环丁烷嘧啶二聚体和 6-4 光产物），尽管也会导致 SSB。事实上，在用 X 射线照射后通常不会发现嘧啶二聚体
对于治疗性辐射，DNA 的损伤是由带电粒子（X 射线的电子，质子，中子的α粒子）轨迹上的能量沉积引起的
- 能量不是在轨迹上均匀沉积的，沉积模式可以归类如下
- "刺"：直径约 4 nm（DNA 直径的 2 倍），沉积 100 eV 能量，约 3 个离子对
  - X 射线通过刺沉积了 95% 的能量
- "斑点"：直径约 7 nm，沉积 100-500 eV 能量，约 12 个离子对
  - 中子和α粒子将大部分能量沉积在斑点中
  - 由于产生的离子对数量更多，DNA 损伤可能比刺中的严重得多
来自刺和斑点能量沉积的损伤会导致 DNA 损伤的多个近端位点，称为局部多重损伤位点
光子辐射产生的 DNA 损伤频率
- 平均每个细胞诱导一个致死事件的剂量为D₀剂量；在统计学上，约 37% 的暴露于 D₀ 剂量的细胞群将存活，而其他细胞将积累一个或多个致死事件
- 对于大多数哺乳动物细胞，光子 D₀ 为 1-2 Gy
- 每个细胞的 DNA 损伤数量，在 D₀ 剂量后立即

每个 D₀ (1-2 Gy) 剂量的事件
电离	~100,000/细胞
碱基损伤	>1000/细胞
单链断裂	~1000/细胞
双链断裂	~40/细胞
细胞死亡	~0.63/细胞 (SF = 0.37)

DNA 损伤的程度受细胞在电离产生的自由基造成损伤之前清除自由基的能力、足够靠近 DNA 以造成损伤的电离数量以及 DNA 修复的有效性的影响。因此，自由 DNA 的辐射损伤频率远高于细胞 DNA
碱基损伤和单链断裂
- 通常有效修复
- 与细胞杀伤无关（例如，过氧化氢会产生频繁的 SSB，但不会导致明显的细胞杀伤）
- 但是，如果修复不正确，可能会导致 DNA 碱基序列发生改变，从而导致突变
- 突变频率通常以剂量依赖的方式增加，但在更高剂量时，致死事件开始占主导地位，存活突变的频率降低
双链断裂
- 与导致细胞杀伤的主要因素有关
- 简单 DSB：定义为单个辐射轨迹导致的两个单链断裂 (SSB) 在大约 6-10 个碱基对内发生 (PMID 9652804)
- 复杂 DSB：此外，其特征在于在断裂末端附近存在其他 DNA 损伤位点（氧化碱基损伤、无碱基 (AP) 位点、单链断裂）
- 辐射会产生一系列结构复杂性 DSB；更高 LET 辐射由于斑点能量沉积会产生更复杂的 DSB。低 LET 辐射也能产生复杂的 DSB
- 链末端通常有悬垂，即一条链比另一条链长几个碱基，这是由不对称断裂造成的
复杂的双链断裂
- 发生在约 30% 的低 LET 诱导的 DSB 中
- 低 LET 辐射的生存曲线肩部被认为反映了细胞的 DSB 修复能力
- 高 LET 辐射没有生存曲线肩部可能是由于复杂 DSB 的高结构复杂性和低修复性
- 据推测，在修复简单的 DSB 后，复杂的 DSB 可能同样是导致低 LET 辐射造成的大部分细胞杀伤的原因
- 复杂 DSB 中高度相关的碱基损伤可能是通过非同源末端连接途径 (NHEJ) 进行修复不良的一个因素
一旦产生了双链断裂，断裂的片段可能会有几种不同的命运
- 以原始构型重新连接 - 这不会对下一次有丝分裂产生持久的影响
- 未能重新连接并保持游离 - 这会导致下一次有丝分裂发生缺失突变
- 重新连接不同的断裂染色体或片段 - 这会导致下一次有丝分裂发生染色体/染色单体畸变，具体取决于 DSB 发生在细胞周期的哪个阶段
历史上，染色体畸变是在暴露于辐射后的第一个中期评分的。因此，根据损伤发生在细胞周期的哪个阶段，存在两种类型的畸变
- 染色体畸变 - 两条姐妹染色单体链都受损。损伤发生在染色体复制之前；S 期在新的姐妹染色单体中复制断裂
- 染色体畸变 - 单条染色单体受损。损伤发生在染色体复制后；互补的姐妹染色单体完好无损
畸变有多种类型，有些是致命的，有些则不是。请参阅 w:染色体异常了解更多信息
- 双着丝点（染色体，致死）：两个不同的染色体发生 DSB。长片段（包含着丝粒）不恰当地连接在一起，两个短片段（无着丝粒）保持游离。包含两个着丝粒的长片段被复制。图像
- 环状（染色体，致死）：一个染色体发生两次独立的 DSB，每次在一个臂上。粘性末端可能重新连接形成环，而两个短片段（无着丝粒）保持游离。包含单个着丝粒的环被复制。图像
- 后期桥（染色单体，致死）：仅在后期显现，发生在染色体复制后。两个染色单体发生 DSB，粘性末端不恰当地连接在一起。在后期，染色体正常分离到相反的两极是不可能的
- 对称易位（染色体，非致死）：两个不同的染色体发生 DSB。断裂片段被交换，粘性末端重新连接。这可能导致癌基因融合蛋白（例如 bcr-abl）
- 缺失（染色体/染色单体，非致死）：一个染色体发生两次独立的 DSB，都在同一个臂上。中间片段脱落，外部片段被不恰当地重新连接。中间片段在下一次有丝分裂中丢失
每个染色体都限制在一个特定的核域内；因此，断裂之间的相互作用并非完全随机。活跃的染色体往往是表面积最大的染色体（例如染色体 8）
这些辐射诱发的 DNA 事件构成了线性二次模型的基础

双链断裂文献

NIH
- 评估由靶向特定 DNA 序列的 125I 标记寡核苷酸产生的辐射诱导 DNA 双链断裂的结构组织
- 2005 PMID 15962759 -- "复杂 125I 诱导 DNA 双链断裂的表征：对修复的意义。"(Datta K, Int J Radiat Biol. 2005 年 1 月；81(1)：13-21.)
  - 结论：复杂的 DSB 在 DSB 末端附近具有高度的碱基损伤聚集
- 2006 PMID 17067210 -- "与位点特异性辐射诱导 DNA 双链断裂相关的碱基损伤聚集的分子分析。"(Datta K, Radiat Res. 2006 年 11 月；166(5)：767-81.)
  - 结论：在 I-125 靶碱基的 8 个碱基内发生碱基损伤聚集。碱基损伤为 8-羟基鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤和 5-羟基胞嘧啶。还有证据表明碱基损伤 >24 bp 上游，可能是通过电荷迁移机制

MRC；2001 PMID 11604075 -- "确定电离辐射诱导的 DNA 损伤谱的计算方法。"(Nikjoo H, Radiat Res. 2001 年 11 月；156(5 Pt 2)：577-83.)
- 蒙特卡罗轨迹模拟。结论
- (1) 每单位吸收剂量的链断裂产率在很宽的 LET 范围内几乎保持不变
- (2) 大多数 DNA 损伤是简单的类型，尽管大多数 SSB 至少伴随一个碱基损伤
- (3) 对于低能电子，大约 20-30% 的 DSB 是复杂的 DSB。随着 LET 的增加，这一比例会增加，对于 α 粒子，这一比例会达到大约 70%
- (4) DNA 局部命中区域的损伤程度仅限于几个碱基对

哥伦比亚大学；1992 PMID 1351522 -- "与 DNA 双链断裂相关的多损伤位点能量沉积和目标大小的限制。"(Brenner DJ, Int J Radiat Biol. 1992 年 6 月；61(6)：737-48.)
- 局部多损伤位点 (LMDS) 是在 1-4 nm 直径内局部化的 2-5 个电离的能量沉积

加州大学圣地亚哥分校；1990 PMID 1971840 -- "电离辐射在细胞内产生的 DNA 双链断裂的产率：综述。"(Ward JF, Int J Radiat Biol. 1990 年 6 月；57(6)：1141-50.)
- DNA dsb 与剂量呈线性关系；不同细胞类型之间的每剂量 DNA 损伤保持不变
- 放射敏感性的差异归因于修复速度和/或准确性的差异

DNA 损伤检测

碱基损伤

高效液相色谱 (HPLC)
从标记胸腺嘧啶中释放氚
磷酸释放
荧光标记

链断裂

对于大多数分析，DSB 在中性 pH (7-10) 溶液中进行评估，而 SSB 在碱性 pH (~12) 溶液中进行评估
这些分析检测到的损伤通常在 24 小时内修复

蔗糖梯度分段 - 离心
- 蔗糖溶液，梯度从 5% 到 30% 不等
- 细胞 DNA 被放射性标记（例如 ¹⁴C）
- 诱导细胞裂解，释放 DNA（根据溶液的不同，为单链或双链）到蔗糖溶液中
- 含有 DNA 的蔗糖溶液然后进行离心
- 较大的 DNA 片段穿过蔗糖溶液的方式与小片段不同
- 然后收集流体的馏分，并分析 ¹⁴C 以评估每个梯度水平存在的 DNA 量
- 从片段大小的分布估计链断裂频率

核体沉降 - 离心
- 使用蔗糖梯度溶液
- 在高盐浓度和非离子型去污剂存在的情况下，在中性 pH 条件下裂解细胞
- 间期核打开，染色质链显露出来。单个断裂的链称为核体，由仍然缠绕在残留蛋白结构上的超螺旋 DNA 组成
- 单链 DNA 断裂使染色质片段能够放松超螺旋并扩大
- 不同大小的染色质片段穿过蔗糖溶液的方式不同
- 有时，会添加荧光染料，可以通过显微镜测量产生的光晕 (= 光晕法)

中性滤膜洗脱 - 洗脱
- 孔径约为 2 mm 的滤膜（DNA 纤维直径约为 25 nm，小 100 倍）
- 细胞 DNA 被放射性标记（例如 ¹⁴C）
- 诱导细胞裂解，释放 DNA（根据溶液的不同，为单链或双链）到滤膜顶部
- 使用洗脱缓冲液溶液将 DNA 片段洗脱通过滤膜
- DNA 洗脱速率与 DNA 片段大小有关
- 双链断裂在 pH 7.4-9.6 条件下进行分析，单链断裂在更碱性的 pH 12.3 条件下进行分析

脉冲场凝胶电泳 (PFGE) - 电泳
- 琼脂糖凝胶
- 细胞 DNA 被放射性标记（例如 ¹⁴C）或电泳后使用 DNA 特异性荧光染料
- 诱导细胞裂解，释放 DNA（根据溶液的不同，为单链或双链）到琼脂糖凝胶中
- DNA 片段带有净负电荷
- 在琼脂糖凝胶上施加电场，DNA 片段的移动速度与其大小成反比
- 可以使用恒定场电泳，但通过以不同方向脉冲场以改变迁移轴，可以改善片段的分离

单细胞凝胶电泳 (彗星试验) - 电泳
- 将细胞嵌入琼脂糖凝胶中，然后裂解细胞以原位释放 DNA
- 施加电场，DNA 片段从细胞核中的 DNA 质量向外迁移
- 由此产生的迁移结构的形状类似于彗星，因此得名
- 双链断裂在中性 pH 条件下进行分析，而单链断裂在碱性 pH 条件下进行分析
- 对 SSB 的敏感度很高，但对 DSB 的敏感度没有那么高

γ-H2AX 测定 - 免疫组织化学/流式细胞术
- IHC 工作量非常大，不容易在常规实践中实施，但可以检测到大约低 10 倍水平的 DNA 损伤
- 该测定是一种高度灵敏的方法，用于检测单个 DSB 的存在（和/或修复）

染色体畸变

稳定的染色体畸变在暴露后可能持续数月至数年
目视观察 - 在暴露于电离辐射后的第一次中期
染色体畸变测定 - 通过 FISH 标记的免疫组织化学

人淋巴细胞中的染色体畸变

广泛用作辐射暴露的生物标志物
在全身照射暴露后，对外周血淋巴细胞中双着丝点和环（见上文）的发生率进行评分
- 剂量反应符合线性二次关系
- 低至 0.25 Gy 的剂量可以检测到，这可用于评估“黑胶片徽章”或潜在事故。
损伤动力学
- 末端缺失 - 单次命中 - 线性响应
- 双着丝粒染色体、易位、环状染色体、链间缺失 - 两次命中 - 二次响应
辐射暴露可以随着时间的推移进行追踪。
- 成熟淋巴细胞的寿命约为 1500 天（约 4 年），并会慢慢从外周血中消除。因此，成熟淋巴细胞中非对称畸变（双着丝粒染色体、环状染色体）的产量会随着时间的推移而下降。
- 干细胞/前体淋巴细胞也会经历 DNA 损伤，其时间进程根据类型而异。
- 不稳定畸变：非对称畸变（例如，双着丝粒染色体、环状染色体）会杀死细胞，不会传递给子代。它们的产量会随着时间的推移而下降。
- 稳定畸变：对称易位可能会无限期地持续，因为它们会通过子代进行传播。它们的产量会随着时间的推移而保持稳定。
- 广岛幸存者在超过 50 年后的易位发生率与当时接受的全身剂量密切相关。