结构生物化学/化学键/二硫键/形成二硫键的多种方式
研究人员最初认为，酶ERO1，内质网氧化还原酶1，将氧还原与从头形成的二硫键偶联，但最近发现，缺乏这种酶的哺乳动物仍然存活并形成二硫键。这表明存在形成二硫键的替代途径。发现表明，过氧化物酶4参与过氧化物的去除和二硫键的形成。哺乳动物 ER 中形成二硫键的许多其他不同途径包括静止硫醇氧化酶、ER 定位蛋白二硫键异构酶过氧化物酶和维生素 K 环氧化物还原酶。这些形成二硫键的各种途径受谷胱甘肽的调节。
许多重要的分泌蛋白和细胞表面蛋白，如抗体、质膜受体和通道、细胞外基质蛋白和血液凝固因子，都含有二硫键，因为二硫键提高了蛋白质的稳定性并控制了氧化还原依赖性功能。内质网中的二硫键经历一个由 PDI，蛋白二硫键异构酶，家族膜催化的过程，然后进行共翻译转运到 ER。当多肽开始折叠时，相互靠近的半胱氨酸残基会形成二硫键，即使它们没有在最终产物中形成。这些最终没有折叠成最终产物的二硫键是错误折叠蛋白质问题的原因，但也可能是正常折叠过程中的中间体。为了获得最终正确折叠的二硫键，错误折叠的二硫键必须在 PDI 家族催化的反应中被分解。因此，PDI 家族在正确形成和还原二硫键的过程中起着至关重要的作用，以确保进入内质网的蛋白质正确折叠。
酶和底物之间二硫键的对应关系是形成二硫键的催化反应发生所必需的。由于 PDI 家族成员各自至少容纳一个硫氧还蛋白结构域，因此 CXXC 基序在其活性位点在二硫醇和二硫键状态之间交替。当二硫键转移到底物蛋白时，活性位点会发生还原。为了使酶能够进行进一步的氧化，必须对活性位点进行脱氧。最初认为，GSSG，谷胱甘肽二硫键，与活性位点如何被再氧化有关。进行体外实验，结果表明，与内质网中发现的类似的 GSH/GSSG 比例将有效地氧化 PDI 中的活性位点半胱氨酸，从而将二硫键转移到底物蛋白上。这些实验没有显示二硫键是如何从头引入的。随着 ERO1p，一种称为内质网氧化还原酶的酵母酶的发现，发现这种酶对于二硫键的形成是必要的。ERO1p 在氧化 PDI 方面发挥着重要作用，而不是分泌蛋白质或低分子量分子，如 GSH，并通过将从头形成的二硫键与氧还原为过氧化氢偶联来催化氧化。虽然 ERO1 被严格调控以防止活性氧物种的过度产生，但它展示了二硫键是如何从头形成的，并且还确定了该途径的最终电子受体。
敲除不同生物体中编码 ERO1p 的基因，得出了关于其重要性的不同结论。当敲除酵母中编码 ERO1p 的基因时，它证明了其作为酵母中必不可少的蛋白质的重要性。高等真核生物的敲除结果不同。当在黑腹果蝇中敲除时，这会导致相对温和的表型，其细胞表面受体 Notch 的折叠存在一定问题。小鼠和人类中存在两个 ERO1 旁系同源物，一对基因 ERO1α 和 ERO1β。当敲除 ERO1 β 时，会导致胰岛素原折叠缺陷。ERO1α 被认为驱动其他组织中二硫键的形成。发现 ERO1α 和 ERO1β 的双重敲除不会导致比单独敲除 ERO1 β 更严重的反应。这表明哺乳动物细胞中存在一条 ERO1 独立的二硫键形成途径，并且双重敲除细胞有助于重新建立正常的内质网氧化还原条件。
PRDX4
由于 H2O2 也是 ERO1 催化的反应产生时产生的，这表明内质网中可能存在其他蛋白质来去除这种活性氧物种。称为过氧化物酶的酶代谢 H2O2 继而形成二硫键。PRDx4 在 H2O2 去除和二硫键形成方面均具有活性。研究表明 PRDx4 在从头形成二硫键方面有新的职责。由于 PRDX4 和内质网内的几个 PDI 家族成员以及等效物，这表明该酶是一种丰富的内质网驻留蛋白。在 PRDX4 在两种蛋白质等浓度孵育期间被一些 PDI 家族成员有效还原的情况下，一些 PDI 蛋白被氧化。这表明，即使 GSH 本身是一种还原剂，但当包括 PDI 时，PRDx4 还原的效率会提高。这表明 PRDx4 和 GSH 之间的二硫键交换形成 GSSP 取决于 PDI 的存在。如果 PRDX4 被 PDI 家族成员还原，分泌蛋白中会快速形成二硫键。这些结果得到了体外证据的证实。由于 PRDX4 增强了 ERO1 的温度敏感突变体，因此酵母在非允许温度下会发生存活和二硫键形成。但是，过表达 PDI 家族成员也会导致 PRDx4 在内质网中还原能力的下降或增加。总之，通过结合 ERO1 和 PRDX4 途径，每个被还原的氧分子会导致两个二硫键的引入，因此使整个过程比单独使用 ERO1 更有效。
GPX7 和 GPX8
GPX7 和 GPX8 是同源酶，属于硫氧还蛋白 GPX 样过氧化物酶家族，它们也可以还原 H2O2。它们是 PDI 过氧化物酶，将 H2O2 的还原与某些 PDI 家族成员的氧化偶联。在这些 GPX 存在的情况下，某些 PDI 家族成员很容易被氧化。在 GPX 和 PDI 都存在的情况下，由 H2O2 介导的还原模型蛋白的氧化重折叠过程会更快。双分子荧光互补显示了 ERO1α 与细胞中两种 GPX 的物理关联。添加 GPX7 后，ERO1α 消耗的氧气体外速率增加，表明在其存在下过程效率更高。这些生化结果表明 GPX7 和 GPX8 在二硫键形成中起着重要作用。
QSOX
Erx2p，一种硫醇氧化酶，过表达可以抑制 ero1-1 突变。这条不同的途径表明，替代蛋白质可能潜在地完成酵母和其他生物体中 ERO1 的基本功能。QSOX，一种已知在体外将二硫键引入蛋白质的黄素蛋白，类似于 Erv2p。QSOX 通过将二硫键氧化与氧还原偶联以形成 H2O2 来催化从头形成的二硫键。与 ERO1 不同，ERO1 专门氧化只有 PDI 家族成员，而 QSOX 的底物特异性更广，可以将二硫键引入蛋白质底物中。但是，PDI 能够大大增强天然二硫键的形成，因为 QSOX 不能异构化非天然二硫键。当过表达时，QSOX 能够补充 Δero1 酵母菌株。这表明 QSOX 在体内参与二硫键的形成。当 ERO1 和 QSOX 都被敲除时，会比单独敲除 ERO1 出现更严重的表型，表明 QSOX 在 ERO1 缺失时可能提供一些功能。由于其混杂的底物特异性和在分泌途径中的位置，QSOX 目前仍然是独立于 ERO1 的从头形成的二硫键的候选者。
VKOR
VKOR 酶展示了另一个潜在的 ERO1 独立的二硫键形成途径。VKOR 是内质网中的一个四跨膜螺旋蛋白。VKOR 的功能是催化维生素 K 环氧化物的两步还原，从而生成维生素 K 氢醌。当维生素 K 环氧化物被还原时，VKOR 中的 CXXC 基序随后被氧化形成二硫键。VKOR 家族中的成员将这种二硫键与硫氧还蛋白样氧化还原酶交换，以氧化底物蛋白。由于人类 VKOR 不含硫氧还蛋白结构域，因此 PDI 家族成员反而充当 VKOR 底物。当活性位点 CXXA 突变体过表达时，VKOR 会被困在与 PDI 家族成员的混合二硫键复合物中，主要是跨膜结合的 TMX 和 TMX4。这些实验的结果表明，VKOR 持续形成二硫键尚不清楚，但证明了一条潜在的途径。
鉴于存在多种潜在的二硫键形成途径，现在需要确定它们的相对贡献。ERO1途径是在正常生理条件下形成二硫键的重要途径。细胞中TRDX4过度氧化表达了ERO1的失控形式，表明该酶在内质网中活性，并具有产生过氧化氢的能力。尽管哺乳动物不一定需要这条途径，但如果它不存在，将损害二硫键的形成。ERO1在决定细胞中PDI的氧化还原状态方面很重要，并且还会与PDI形成混合二硫键。这表明ERO1具有氧化PDI的能力。如果动物没有ERO1来生存，但仍然能够形成二硫键蛋白，则表明存在其他途径。它们各自的贡献仍需进一步探索。
PRDX4依赖性途径对二硫键的形成没有显著贡献。如果它确实有贡献，那么可以预测Prdx4敲除小鼠应该表现出严重的表型。尽管Prdx4敲除小鼠存活，但由于睾丸的氧化应激而导致不育。因此，PRDX4途径被认为对于特定组织的正常功能至关重要，但并非生存所必需。如果在高等真核生物中存在更高浓度的PRDX4，则表明ERO1敲除的轻微表型，因为PRDX4途径可以使用可获得的过氧化氢作为替代来源。需要更多研究来确定哪些来源提供了驱动二硫键形成所需的H2O2。即使PRDX4为ERO1提供了二硫键形成的替代途径，也需要确定PRDX4途径的重要性。
在内源性水平下，GPx7和GPx8酶不能在ERO1敲除细胞中取代PrdxIV。这些酶可能与PRDX4具有相似的功能。研究表明，过氧化还原蛋白家族的蛋白质对H2O2的反应速度高于GPXs。有证据表明，Ero1α在体内与GPXs的相互作用可以弥补其相对较慢的反应速度。为了解释这些酶在从头二硫键形成中的作用，需要进一步了解它们的特征。目前的研究表明，VKOR在二硫键形成中的细胞功能基本上尚未被阐明。然而，在VKOR中，与PDI家族成员形成的混合二硫键确实暗示其在该过程中的作用。由于其通量较低，VKOR氧化PDI的途径与γ-羧基谷氨酸形成严格耦合并不重要。如果氢醌可以通过另一种电子受体重新氧化，情况并非如此。这可能会在该途径中发挥更重要的作用。
如体外实验所示，H2O2直接氧化PDI和底物蛋白中的半胱氨酸以形成二硫键可能发生。然而，这些途径被证明并不重要，因为当反应混合物中同时存在H2O2和PDI家族成员以及PDI过氧化物酶或PRDX4时，底物重折叠的动力学更快。脱氢抗坏血酸是内质网中氧化当量的另一个来源。DHa可以从胞质溶胶转移到内质网，在内质网中生成，并且像H2O2一样，DHa直接氧化PDI并在体外使还原的蛋白质展开。由于其速度较慢，前一条途径被证明不是还原DHa的主要途径。一条更快的途径是蛋白质底物的PDI无关氧化，其速度更快。
参考文献
[edit | edit source]Bulleid NJ, Ellgaard L. Trends Biochem Sci. 2011 Sep;36(9):485-92. Epub 2011 Jul 19. Review. PMID: 21778060 [PubMed - indexed for MEDLINE]a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21778060