结构生物化学/色谱法/柱
柱色谱法是另一种用于分离蛋白质或其他分子的方法。它本质上是薄层色谱法（TLC）的倒置版本 - 依赖于相同的物理原理，只是 TLC 是通过毛细管力驱动溶剂移动的，而柱色谱法则依靠重力驱动洗脱液向下流动。在这种方法中，待分离的样品被施加到玻璃柱的顶部。然后，玻璃柱被装填有固相。这种固相的目的是将样品中的化合物分离成不同的区域。硅胶 (SiO2) 和氧化铝 (Al2O3) 是常见的吸附剂。预计首先从柱中洗脱的成分是与硅胶相互作用最少的成分，因此也是极性最小的成分。洗脱液将可溶性化合物带走。当柱中填充硅胶时，预计首先从柱中洗脱的成分是与硅胶相互作用最少的成分，因此也是极性最小的成分。洗脱液将可溶性化合物带走。洗脱液的极性可以从非极性溶剂逐渐增加到极性溶剂，因为随着非极性成分的先被收集，留在柱中的成分带就更极性。更极性的溶剂将更有效地带走留在柱中的极性成分。在使用柱色谱法根据各自极性分离混合物后，应使用薄层色谱法来分离混合物，以观察馏分的分离情况，并将任何“爬”到相同距离的馏分组合在一起。使用 TLC 发现具有相同极性的化合物被组合在一起，并通过测量其熔点并与文献值进行比较来进行分析。样品量用于计算原始样品中每种成分的初始浓度。如果化合物是彩色的，这很容易做到，但如果化合物是透明溶液，则可以进行 CAM 染色（也可以使用碘）或在紫外线下追踪其位置。在收集这些带后，可以将溶液置于旋转蒸发器中以蒸发掉溶剂，得到纯化合物。如果溶剂易挥发，可以在通风橱中或过夜蒸发。样品也可以在沙浴中加热。
一旦用干燥的固定吸附剂材料（如硅胶）装填柱后，通常有两种方法进行柱色谱：湿装填和干装填。混合物在极性或非极性溶剂中的溶解能力决定了柱色谱法的方法。
- 在湿装填方法中，吸附剂悬浮在溶剂中，并将浆液作为洗脱液转移到柱中。这种方法最常用于所需分离混合物可溶于极性最小的溶剂或非极性溶剂的情况下。如果使用过量的极性溶剂，则它会留在柱内并增加局部极性，这会导致柱上的分离混合在一起。
- 在干装填方法中，混合物首先溶解在最小量的溶剂中，并加入吸附剂材料。一旦溶剂与混合物和吸附剂混合并蒸发，干燥的化合物就可以加入到柱中。在加入干燥的化合物后，用流动相（可以是具有不同极性的极性溶剂，但应以增加的极性顺序添加）冲洗柱，并且在添加流动相后，不允许柱变干。这种方法最常用于混合物仅可溶于比所选洗脱液更极性的溶剂中。
化学化合物在柱内分离并收集。然后可以测试分离后的样品的纯度和其他性质。当样品施加到柱顶时，它也会用溶剂洗涤。当样品在柱内的固相上移动时，样品中的不同分子或化合物将开始彼此分离形成区域。样品中的化合物将与固相结合，但样品也会从固相释放，然后与流过它的液体溶剂结合。这是一个连续的过程。一种化合物将与固相结合，然后释放并与溶剂结合。然后它会重新结合到固相，然后再次结合到液体溶剂。这个过程随着化合物向下移动柱子而不断发生。样品中不同的分子将对固相或液相具有不同的结合亲和力，这些亲和力的差异使得混合物中的分子以不同的速度移动并与其他化合物分离。（注意：*以上部分是对有机化学中柱色谱法的描述。）这种方法在生物化学中被称为反相色谱法。
决定化合物移动距离的因素有 1）溶剂与吸附层之间的相互作用，2）溶质与吸附层之间的相互作用，3）溶质、溶剂和吸附层的极性，以及 4）溶液的重量。为了确定化合物移动的距离，可以计算滞留因子（Rf）。Rf 值可以通过查看在运行柱后收集的馏分点样的 TLC 板来找到。Rf 值是溶质移动的距离与溶剂移动的距离之比。Rf 的范围是 0 到 1。如果计算出的 Rf 值高于预期，则在运行柱时应使用更少的极性溶剂。
有机化学实验室第三版，包括定性分析，作者：Bell Jr, Charles E; Taber, Douglas F.; Clark, Allen K. Harcourt College 出版社