结构生物化学/DNA修复/多核苷酸激酶/磷酸酶在DNA链断裂修复中的作用
DNA链断裂通常是由内部和外部因素引起的。在这些链断裂后，它们需要在被DNA聚合酶替换缺失的核苷酸并被DNA连接酶重新连接之前进行处理。多核苷酸激酶/磷酸酶在修复DNA链断裂中起着重要作用，它通过催化DNA末端的恢复来发挥作用。除此之外，PNKP还通过与其他DNA修复蛋白（如XRCC1和XRCC4）的相互作用，帮助其他DNA修复途径。PNKP在维持正常组织（如发育中的神经细胞）的基因组稳定性、增强癌细胞对基因毒性治疗剂的抵抗力方面很重要。
当细胞DNA受到损伤时，会导致衰老、癌症的病因和治疗以及神经系统疾病。DNA损伤有不同的形式，如：碱基修饰和碱基丢失以及链断裂。这些损伤可能是由细胞内因素（如初级活性氧物种（ROS））和外源因素触发的。为了保护自己免受这种损伤，细胞已经进化出一系列修复途径。这些途径可以抵消由于DNA损伤而产生的突变和细胞毒性后果。导致链断裂的各种机制包括：通过物理和化学手段（如电离辐射 (IR) 和 ROS）以及酶促过程进行切割。因此，链断裂呈现出多种形式，不同的链断裂可以根据其末端的性质进一步分类或细分。PNKP 酶具有 5'-激酶和 3'-磷酸酶活性，这对处理单链和双链断裂末端至关重要。对 PNKP 的研究表明，这些酶的小分子抑制剂会使细胞对 IR 或化疗药物敏感。研究人员还发现，导致 PNKP 发生改变的突变，类似于编码其他链断裂修复蛋白的其他基因的突变，与严重的常染色体隐性遗传神经系统疾病有关。
电离辐射 (IR) 通过产生羟基自由基，导致具有各种末端基团的 3'-末端发生链断裂。通过产生羟基自由基，脱氧核糖基团内不同碳原子的反应会产生两个主要的末端基团：磷酸盐和磷酸乙醇酸。磷酸乙醇酸的形成取决于氧气的存在，而 3'-磷酸基团是在常氧和缺氧条件下产生的。另一方面，在 5'-末端，主要的末端基团是磷酸盐。除了引起链断裂外，电离辐射还会产生复杂的病变。这些区域包含两个或多个紧密排列的受损碱基或链断裂，以及单一受损位点。复杂的病变包括法兰克 DSB，SSB:DSB 比率确定为约 25:1。另一个导致链断裂的因素是过氧化氢。与 IR 介导的损伤类似，过氧化氢引起的法兰克 DSB 远少于 IR 介导的损伤。博来霉素是一种化疗药物，还会在 3'-磷酸乙醇酸末端产生 DSB。
拓扑异构酶 1 产生一个带有 5'-OH 末端的 DNA 切口，并与共价 3'-磷酸-酶中间体连接，以缓解扭转应力。使用拓扑异构酶，喜树碱阻止了由此产生的链重连，留下了一个 DNA-酶“死胡同”复合体。通过酪氨酸-DNA 磷酸二酯酶水解这种复合体，会产生更多带有 3'-磷酸和 5'-OH 末端的切口。
使用 DNA 糖基化酶，可以去除受损的碱基。然后，无碱基位点被两类酶中的其中一类切割。其中一类酶，AP 核酸内切酶，水解 3' 到无碱基位点的磷酸二酯键，以产生 3'-OH 和 5'-脱氧核糖磷酸末端。通过使用 DNA 聚合酶 β，5'-脱氧核糖磷酸末端可以转化为 5'-磷酸。AP 裂解酶通过 β-消除反应，切割 3' 到无碱基位点的磷酸二酯键，在一个末端产生与 3'-磷酸连接的 β-不饱和醛，在另一个末端产生 5'-磷酸。由于许多 DNA 糖基化酶具有这种酶活性，因此戊烯醛部分可以被 AP 核酸内切酶消除以产生 3'-OH，或者被 AP 裂解酶消除以产生 3'-磷酸。NEIL1 和 NEIL2 酶是具有 β,δ-裂解酶活性的哺乳动物 DNA 糖基化酶，它们能去除大量的突变和细胞毒性氧化嘧啶损伤以及嘌呤衍生的甲酰胺嘧啶。
PNKP 构成一个多域酶。它包含 2 个域：一个 N 端叉头相关 (FHA) 域和一个 C 端催化域，该催化域由融合的磷酸酶和激酶亚域组成。使用灵活的多肽段将两个域 FHA 和催化域连接在一起。这种灵活的多肽段可选择性地结合 XRCC1 和 XRCC4 中的酸性酪蛋白激酶 2 (CK2) 磷酸化区域。XRcc1 和 XRCC4 是重要的支架蛋白，可修复 DNA SSB 和 DSB。Aprataxin 和 APLF 是 DNA 修复因子，也包含 FHA 域，同样结合 CK2 磷酸化的 XRCC1 和 XRCC4。这种功能可能导致这些蛋白质的协调调节，从而导致磷酸化支架因子的结合。PNKP 和 T4 多核苷酸激酶在其催化域中是相似的，因为它们都包含连续的激酶和磷酸酶域，但不同之处在于 T4 酶缺乏 FHA 域，并且激酶亚域位于磷酸酶亚域的 N 端。
小鼠 PNKP 蛋白的两个催化活性位点位于蛋白质的同一侧。小鼠和 T4 激酶亚域共享一个类似的双重活性位点裂缝结构，该结构具有独立的 ATP 和 DNA 结合位点。ATP 结合位点的结构包括 Walker A（P 环）和 B 基序，这些基序在各种激酶中都是保守的。此外，它还携带一个天冬氨酸，该天冬氨酸激活 5'-羟基，以攻击 ATP γ-磷酸。哺乳动物和噬菌体酶之间的 DNA 结合位点不同。虽然噬菌体 PNK DNA 结合裂缝形成一条通向保守的催化天冬氨酸残基的狭窄通道，该通道可容纳单链底物，但哺乳动物酶磷酸化切割、缺口或双链断裂（DSBs）中具有单链 3' 悬垂端的 5' 羟基末端，因为单链 5' 末端的磷酸化效率较低。一个由两个不同的带正电荷表面组成的宽阔 DNA 识别沟，选择性地识别较大的双链 DNA 底物。通过使用来自小角度 X 射线散射实验的结构信息，再加上氨基酸取代对激酶表面的影响，研究人员发现 DNA 底物以确定的方向跨越这些表面结合。
许多磷酸酶采用的典型过程是卤代酸脱卤酶折叠。这些酶采用的机制依赖于 Mg2+，同时通过催化天冬氨酸和酰基磷酸中间体进行。哺乳动物 PNKP 在多种 3'-磷酸末端上执行其过程，例如那些位于切口、缺口、DSBs 和单链末端内的末端。两个被大的带正电荷环包围的狭窄通道形成通往磷酸酶活性位点的通路，但不足以容纳双链底物。这表明为了容纳双链底物，需要对磷酸酶底物结合表面的重塑或 DNA 的解旋。
DNA 修复支架蛋白 XRCC1 和 XRCC4 与 PNKP 功能相互作用，这是由 PNKP FHA 结构域与 XRCC1 和 XRCC4 上的磷酸化基序结合介导的。FHA 结构域是磷酸肽结合模块，具有 β-三明治折叠，其中一系列环从 β-三明治的一侧突出并提供一个肽结合表面，该表面对包含磷酸苏氨酸残基的目标具有明显的偏好。即使 XRCC1 和 XRCC4 在结构上不相关，但它们共享类似的基序，这些基序被 CK2 磷酸化并充当 PNKP FHA 结构域的结合位点。当 XRCC1 中残基 515 和 526 之间的 CK2 磷酸化位点簇（该簇对于与 PNKP 的相互作用是必需的）发生氨基酸取代时，SSB 修复效率会显着降低。同样，XRCC4 中的一个主要 CK2 位点 THr233 对于 PNKP 结合和体内高效修复 DSBs 是必需的。在这些位点周围显示出显着的序列保守性。保守的丝氨酸发生磷酸化，并且该复合物相对于主要磷酸苏氨酸的结构揭示了该残基与 PNKP FHA 结构域的 ARG35 或 ARg44 之间的动态相互作用。酪氨酸残基在 -4 位点是保守的，而天冬酰胺残基在 +3 位点是保守的。一些反应在 FHA 结构域中与 XRCC4 的复合物中不保守。+3 位点的残基是谷氨酸。由于肽的酸性性质和残基之间的长程静电相互作用，带正电荷的肽结合表面主要有助于结合特异性。+4 位点的苏氨酸磷酸化也通过募集第二个 PNKP FHA 结构域在结合选择性中起作用。
PNKP 和单链断裂修复 (SSBR)
[edit | edit source]多酶通路 SSBR 使用不同的参与者，具体取决于致病因子。例如，IR 诱导的链断裂，涉及丢失至少一个核苷酸。由酶聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、XRCC1、AP 核酸内切酶 1 和 PNKP 负责断裂末端处受损链的识别和校正，而其他蛋白质则充当这些功能的备份。通过使用涉及 DNA 聚合酶 β 和 DNA 连接酶 III 的短补丁通路或使用 DNA 聚合酶 δ 和/或 ɛ、FEN1 核酸内切酶和 DNA 连接酶 I 的长补丁通路，可以连续替换核苷酸和链重新密封。当发生 IR 时，APE1 去除 3'-磷酸甘油酸，而 PNKP 水解 3'-磷酸基团。当 APE1 的 3'-磷酸酶活性远弱于 PNKP 时，就会发生这种情况。PNKP 酶还在确认 5'-OH 末端被磷酸化方面发挥作用。由于 PNKP 的磷酸酶活性远高于激酶活性，因此当链断裂同时具有 3'-磷酸和 5'-OH 末端时，PNKP 的活性优先考虑。在哺乳动物细胞中，当磷酸酶缺陷型 PNIKP 的过表达无法补偿 Xrcc1 缺陷时，PNKP 中的磷酸酶活性被证明对快速修复过氧化氢诱导的 SSBs 至关重要。相应地，PNKP 磷酸活性的另一个重要因素涉及一种小分子抑制剂，该抑制剂显着阻碍了受照射人细胞中的 SSBR。虽然这里表明 PNP 中存在重要的磷酸酶活性，但 5'-激酶活性的生理重要性尚未确定。
辐射诱导的 SSBS 修复的普遍接受的模型是 SSB 催化 ADP-核糖链在受体染色质蛋白和自身上的聚合。通过这样做，SSBR 会吸引支架蛋白 XRCC1，并且可能还会紧密结合 DNA 连接酶 III。然后，这些蛋白质反过来募集 PNKP 或 APE1，以恢复 DNA 聚合酶 β 所必需的末端基团，以便它可以添加缺失的碱基并允许 DNA 连接酶 III 重新连接链。通过研究和分析蛋白质-蛋白质相互作用，发现 XRCC1 与 PNKP 之间存在直接相互作用，以及与 DNA 聚合酶 β 和 DNA 连接酶 III 之间的相互作用。这表明这些连接的伙伴关系包括四种蛋白质之间的四聚体复合物。这种形成可以为各种模型形成。虽然有证据表明 XRCC1 和 PNKP 之间存在相互作用，但也存在证据反驳了 XRCC1 募集 PNKP 或 APE1 到链断裂处的概念。通过使用将蛋白质交叉连接到 DNA 底物的技术，进行了实验以追踪 HeLa 细胞中 SSBR 蛋白的时序关联。通过这种孵育过程，发现对于具有 3'-磷酸甘油酸末端或 3'-磷酸末端的底物，APE1 和 PNKP 在 XRCC1/DNA 连接酶 III 之前被募集到链断裂处。除了这一发现，还发现 APE1 或 PNKP 的免疫耗竭减少了 XRCC1 对以下底物的结合。这表明 APE1 和 PNKP 将 XRCC1 诱导到氧化损伤部位，而不是反之。相反，发现在表达 XRCC1 的过氧化氢处理的细胞的细胞核中存在 PNKP 灶，但在缺乏 XRCC1 的细胞中不存在。这表明，虽然在 PNKP 或 APE1 的起始阶段可能不需要 XRCC1，但它加速了这些特定酶在染色体损伤部位的灶状积累和激发。
即使 DNA 修复蛋白 XRCC1 缺乏固有的酶活性，它也能够增强 PNKP 的激酶和磷酸酶活性。通过使用荧光测量来确定 PNKP 与模拟不同链断裂的底物之间的结合机制，发现了围绕 XRCC1 诱导的刺激的机制。即使 PNKP 与具有 5'-OH 末端的切口底物紧密结合，Kd 值为 0.25 μM，但这仅比 PNKP 与带有 5'-磷酸的相同双链体结合紧密 5-6 倍。这表明 PNKP 仍然与它自身的激酶活性的产物结合。结果表明，XRCC1 的存在不影响 PNKP 与非磷酸化底物的结合。但进一步的结果还表明，PNKP 与磷酸化双链体的相互作用被废除了，因此表明 XRCC1 确实影响了结合并将 PNKP 从反应产物中置换出来。通过跟踪在限制性酶浓度下产物积累的动力学证据，证实了添加 XRCC1 会增加 PNKP 酶周转的结果。进一步的数据表明，对于 PNPK 磷酸酶活性，观察到了类似的动力学数据。
PNKP 与 XRCC1 之间的关系进一步复杂化，因为 CK2 介导的 XRCC1 磷酸化。虽然促进与其他蛋白质的相互作用，但 XRCC1 磷酸化也起作用稳定 XRCC1-DNA 连接酶 III 复合物。在体外发现了 CK2 介导的 XRCC1 磷酸化的多个位点，这些位点聚集在特定位置内。为了将 XRCC1 和 PNKP 募集到过氧化氢处理或 γ 辐射细胞的核灶中，需要 XRCC1 磷酸化。XRCC1 磷酸化也需要促进 SSBs 的更快速修复。如果细胞缺乏 XRCC1 磷酸化，这不会影响细胞存活。但通过进一步的研究和分析，发现没有功能性 XRCC1 的细胞（具有三突变 XRCC1）将无法完全恢复快速的 SSBR，这表明确实存在与 PNKP 的重要相互作用。通过过表达 PNKP 可以轻松完成细胞的修复。这表明 XRCC1 在增加 PNKP 酶周转方面发挥着重要作用，尤其是在细胞中包含限制性的 PNKP 浓度时。
与未磷酸化XRCC1相比，CK2对XRCC1的磷酸化促进了体外测量的PNKP的激酶和磷酸酶活性。相反，未磷酸化XRCC1的刺激是由于PNKP的酶促周转率增强。这种情况带来了问题，因为可以看出磷酸化和未磷酸化XRCC1以不同的位点和不同的亲和力结合PNKP，但两者都能通过类似的机制刺激PNKP。研究发现，磷酸化XRCC1与FHA结构域结合的Kd值为4 nM，而未磷酸化蛋白质与PNKP的催化结构域结合的亲和力弱10倍。这表明在人细胞中存在PNKP和XRCC1之间可能存在独立于磷酸化的相互作用。研究人员发现，PNKP与在人293T细胞中表达的XRCC1三突变体共免疫沉淀。虽然细胞XRCC1的85-90%是磷酸化的，但这并不意味着与FHA结构域相互作用的关键氨基酸簇完全被磷酸化。该簇磷酸化的增加以及PNKP与XRCC1共纯化的约3倍增加是由于用过氧化氢处理细胞所致。这表明细胞可能在增强CK2介导的XRCC1磷酸化及其随后与PNKP FHA结构域的相互作用方面发挥作用。这种增强直接响应于过氧化氢或辐射的对抗，以有效地处理相当高水平的DNA损伤。另一方面，未受应激的细胞能够通过不同的方法来应对相对较低的内源性DNA损伤水平。通过使用未磷酸化的XRCC1，或磷酸化程度有限的XRCC1，它能够通过与催化结构域结合来激活PNKP。
由于细胞中PNKP的耗竭和裂殖酵母中Pnk1的缺失，细胞对喜树碱敏感。XRCC1通过与TDP1、DNA连接酶III和PNKP形成复合体，忽视了这些断裂的修复。神经退行性疾病，伴有轴索神经病变的脊髓小脑共济失调1型，是由TDP1突变引起的。研究表明，SCAN 1细胞修复喜树碱诱导的SSB的能力降低，并且修复过氧化氢诱导的SSB的速度也较慢。这一证据表明，TDP1对于修复由氧化过程产生的损伤至关重要，这些损伤可能解释了SCAN1中观察到的神经退行性变。裂殖酵母G0中Tdp1和Pnk1实验表明了这一点，它们按顺序起作用以处理天然发生的SSB的3'末端。
PNKP和碱基切除修复（BER）
[edit | edit source]细胞机制BER，碱基切除修复，负责修复由IR、ROS和烷化剂决定的大多数次要碱基修饰。该机制的第一步是通过DNA糖基化酶去除修饰的碱基，然后使用APE1在新形成的无嘌呤/无嘧啶（AO）位点切割DNA。另一种方法是使用糖基化酶以其AP裂解酶活性水解AP位点。随着nei核酸内切酶VIII样-1（NEIL1）和NEIL2哺乳动物DNA糖基化酶的发现，PNKP参与BER途径是无可争辩的。nei核酸内切酶VIII样-1（NEIL1）和NEIL2哺乳动物DNA糖基化酶具有β,δ-AP裂解酶活性，产生3'磷酸末端。这些糖基化酶不是直接与PNKP结合，而是与包含其他BER成分（包括PNKP）的大型复合体相关联。这些糖基化酶的功能是承担各种碱基损伤，包括：胸腺嘧啶乙二醇、5-羟基尿嘧啶和8-氧鸟嘌呤。除了此功能外，糖基化酶还可以切割由不具有AP裂解酶活性的糖基化酶产生的完整无碱基位点，以及由其他DNA糖基化酶的β-消除AP裂解酶产生的戊烯醛部分。由于此NEIL糖基化酶将与APE1竞争，从而形成不同的、独立于APE1的BER途径的基础。虽然目前的研究无法表明NEIL1或NEIL2催化的无碱基位点切割在细胞中出现的程度，但这些位点的切割可能解释了PNKP耗竭的细胞对烷化剂甲基甲磺酸盐（MMS）敏感性增加的原因。这种对MMS的敏感性在实验中令人惊讶，因为该试剂造成的重大损伤是N7-甲基鸟嘌呤和N3-甲基腺嘌呤，几乎没有直接的链断裂。下调Aprataxin的表达也会导致细胞对MMS敏感。但是，由于人类DNA糖基化酶负责去除这些甲基化的碱基，而不具有AP裂解酶活性，因此MPG产生的无碱基位点生成具有3'磷酸末端的断裂的能力必须归因于NEIL1或NEIL2。
PNKP和双链断裂修复（DSBR）
[edit | edit source]在两个主要的双链断裂修复途径中，有证据表明PNKP参与非同源末端连接。但是，相反，由于PNKP缺失未能影响IR诱导的姐妹染色单体交换，这表明PNKP可能实际上不参与同源重组。除了其他途径外，PNKP还充当备用的、依赖XRCC1的DSB修复途径。实验通过使用人类细胞无细胞提取物显示了PNKP参与的证据。这些证据表明，在结合具有5' -OH末端的线性化质粒底物之前，需要PNKP激酶活性。XRCC4和DNA-PK对于确定磷酸化的成功程度至关重要。与XRCC1将PNKP与DNA连接酶III连接的作用类似，XRCC4将PNKP与DNA连接酶IV连接。CK2介导的XRCC4 Thr233磷酸化在与PNKP FHA结构域相互作用以及顺利刺激XRCC4-DNA连接酶IV介导的5'去磷酸化质粒底物的体外连接方面发挥作用。在Xrcc4缺陷细胞系中，当表达XRCC4而不是野生型XRCC4时，照射后存活率降低了约30%，从而减缓了DSB修复的速度。
通过生物物理和生化检查确定了XRCC4-PNKP相互作用的功能作用。虽然XRCC4的磷酸化支持与PNKP的紧密亲和力，但未磷酸化的XRCC4也能够与PNKP结合。虽然在这种特定情况下，结合是与PNKP的催化结构域结合，从而削弱了亲和力。类似于XRCC1刺激PNKP从SSB周转的能力，未磷酸化的XRCC4能够刺激pNKP从DSB的酶促周转。研究发现，磷酸化的XRCC4的存在未能刺激PNKP，因此阻止了PNKP介导的DNA磷酸化。但是，随着DNA连接酶IV的额外加入，它与磷酸化的XRCC4形成的复合物能够逆转抑制并刺激PNKP周转。在HeLA细胞中的蛋白质中发现XRCC4：DNA连接酶IV：PNKP的比例约为7:1:3，其中几乎一半的XRCC4在Thr233处被重要地磷酸化。这表明在细胞中，只有一部分XRCC4可以与DNA连接酶IV复合，从而表明XRCC4和PNKP之间可能存在独立于FHA的相互作用。使用XRCC4与PNKP的共免疫沉淀，证实了XRCC4和PNKP之间独立于FHA的相互作用，用于在耗尽内源性PNKP的细胞中表达。PNKP还具有处理DSB 3'磷酸乙醇酸末端的重要功能，尤其是3'悬垂和钝端末端。这些末端是由IR、博来霉素和烯二炔化合物（如新癌霉素）产生的。即使APE1能够去除SSB末端和凹陷DSB末端的磷酸乙醇酸基团，但在钝端DSB末端，它会失去其有效性，而在悬垂末端，它完全无效。
PNKP的生理作用和临床潜力
[edit | edit source]PNKP参与多个DNA修复途径，以保护细胞免受内源性和外源性基因毒性物质的影响。当NHEU基因和SSBR/BER基因发生破坏时，会出现各种症状的神经系统疾病。一个例子是微脑畸形。在编码DNA连接酶IV的LIG4发生突变的人群中，会出现微脑畸形。小鼠中Xrcc1的缺失会导致癫痫发作。研究发现，PNKP突变是导致一种严重的神经系统常染色体隐性遗传疾病的原因，该疾病的特征是微脑畸形。症状包括难治性癫痫发作和发育迟缓。通过对家族的分析，在激酶和磷酸酶结构域中都发现了突变。通过收集所有MCSZ患者表现出的症状，表明PNKP参与了多种DNA修复途径。
PNKP也被证明与病理生理状况相关。观察到，PNP在关节纤维化组织中的表达升高表明PNKP在减轻巨噬细胞产生的ROS的影响方面发挥作用。在另一项实验中也观察到，生理上和环境上相关的镉和铜剂量已知会引起神经毒性和致癌作用，从而抑制PNKP。
肿瘤细胞的 DNA 修复能力在临床对许多抗肿瘤药物的反应中起着重要作用。因此，目前正在研究几种 DNA 修复酶，例如 PNKP 的抑制剂。这些抑制剂具有使细胞对辐射和化疗药物敏感的能力，因此对研究具有重要意义。通过这项研究，研究人员发现了一种小分子抑制剂，能够抑制 PNKP 磷酸酶活性，并增强细胞对 IR 和喜树碱的敏感性。喜树碱是两种临床常用的拓扑异构酶 I 毒物——伊立替康和拓扑替康的母体化合物，这两种药物常用于治疗结肠癌和卵巢癌。
PNKP 是一种重要的酶，参与细胞对断裂链末端的加工。PNKP 由于其有益的特性而参与许多 DNA 修复途径。需要进一步研究以确定 PNKP 的调控机制、与其他修复酶的协作机制以及在神经元和其他组织中的生理作用。PNKP 被认为是癌症治疗中的一个治疗靶点，因为它参与多种修复途径。因此，需要识别、研究和优化新的抑制性化合物以用于临床。进一步的研究应投入到识别 PNKP 的合成致死伴侣，以观察其作为单一药物针对缺乏蛋白的肿瘤的潜在应用。
Weinfeld, Michael. "Tidying up loose ends: the role of polynucleotide kinase/phosphatase in DNA strand break repair." Trends in Biochemical Sciences 36.5 (2011): 262-71. PubMed. Web. 21 Nov. 2012.