结构生物化学/DNA重组技术/DNA测序
DNA测序 确定DNA分子中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序。DNA测序可以了解各种各样的遗传信息。在DNA操作方面，它是最简单的技术之一。
关于DNA测序：限制性内切酶导致了重组DNA。细菌会产生限制性内切酶，这种酶会根据特定的短碱基序列切割DNA。在自然界中，限制性内切酶可以保护细菌免受病毒的异源DNA侵害。在试管中，纯化的限制性内切酶被用于“切割和粘贴”来自两种无关生物的DNA，从而产生重组DNA。“基因克隆”构建的人工重组DNA最终使得利用从细菌转化自然现象中获得的过程，在几乎所有类型的生物体基因组之间转移基因成为可能。
第一个成功的测序方法被称为桑格测序，以其发明者弗雷德里克·桑格命名。这种方法是革命性的，开辟了无数的研究途径。然而，它在时间、成本和材料方面仍然是低效的。噬菌体fX174是一种只有5368个碱基对的病毒，是第一个在1978年被测序的，之后还有很多其他病毒被测序。然后，在1983年，PCR方法被开发出来，可以扩增特定的DNA片段。后来，在1986年，CIT的勒罗伊·E·胡德实验室和史密斯宣布了第一台半自动DNA测序机。接下来，鸟枪法由克雷格·文特尔在199年创建。这种方法可以更快地进行测序。
另一种测序方法是荧光检测。在这种方法中，荧光标签用于标记每个不同的双脱氧类似物。然后进行电泳，分离的DNA条带穿过。碱基被标记为不同的颜色，使其身份明显，序列很容易确定。
也许最大的提议是在1990年，当时人类基因组计划被提议并启动，旨在编目整个人类基因组。后来，由克雷格·文特尔领导和创建的团队在TIGR的设施中对最大的细菌进行了测序，总共1.8 Mb。之所以能够实现这样的壮举，是因为计算软件的改进，这些软件被创建来处理鸟枪法创建的极其庞大的数据集。他们不是一次对基因组的极小片段进行鸟枪法测序，而是对整个基因组一次性进行测序。然后TIRG组装器（软件名称）将24,000个碱基对识别为一个完整的基因组。这种新的测序方法将所需的成本和时间几乎减少了一半。人类基因组计划的开放获取政策允许任何学术机构使用所有收集的数据，并帮助改变了我们对基因组的工作知识。然而，克雷格·文特尔的项目Celera最初拒绝公布其数据，直到他被迫这样做。该小组现在仍然是该行业最有影响力的领导者之一。在2003年底，除了少数几个空白外，整个人类基因组被宣布完成，预示着科学新时代的到来。
测序DNA 可以通过应用化学或酶促方法来阐明。基本酶促方法是基于DNA聚合酶的能力，即延伸与待测序的单链DNA杂交的引物，直到掺入链终止双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)。ddNTP在碳3'缺少一个羟基，下一个dNTP的生长DNA链会添加到该位置。ddNTP用作链终止剂，因为在碳3'没有羟基的情况下，就不能再添加任何核苷酸，DNA聚合酶会脱落；DNA链在标记的G、A、T或C处停止。得到的片段具有共同的起源，但在不同的核苷酸处终止，导致长度混合的DNA链。每个片段被标记，每个双脱氧类似物（终止剂）被标记为不同的荧光颜色。它们通过使用高分辨率凝胶电泳进行分离，这种方法根据它们的不同大小进行分离；较短的链在凝胶中移动得更快。一旦链穿过凝胶，它们的身份可以通过荧光测量来检测（取决于它们的颜色）。描述的以下技术在许多不同的方法中使用，并被认为是常识。
放射自显影的替代方法是“荧光检测”。作为标签使用的荧光蛋白存在于许多腔肠动物（如珊瑚和水母）的发光和产色细胞中。在荧光标签连接到每个双脱氧类似物后，不同的链终止剂具有不同的颜色。荧光是指光被分子吸收并以更长波长重新发射（有时会落入可见光范围，因此人类的眼睛可以看到），产生特定的颜色。当它被光激发时，荧光会在没有能量输入（如ATP或任何其他辅因子）的情况下发出荧光。然后，通过终止剂的混合物，反应可以分别进行，并且片段的混合物可以通过凝胶电泳分离。DNA条带可以通过它们的颜色来检测，因为它们会出现。例如，如果所有腺嘌呤双脱氧类似物都被标记为绿色标签，并且比引物长5个碱基的片段呈绿色，则已知引物后第五个碱基是腺嘌呤。这种方法使我们能够找到具有多达500个碱基的多核苷酸的序列。这是一个可行且有竞争力的解决方案，因为它消除了放射性成分的使用，并且可以自动化。因此，每天可以测序超过100万个碱基。
荧光检测器可能是现有现代HPLC检测器中最灵敏的。即使在流通池中存在单个分析物分子，也可以检测到。通常，荧光灵敏度对于强紫外线吸收材料而言，比紫外线检测器高10-1000倍。荧光检测器在其他光学检测器中非常特异和选择性。这通常被用作在样品中测量特定荧光物质的优势。当具有特定官能团的化合物被更短波长能量激发并发射更高波长辐射时，这种辐射被称为荧光。通常，发射是在与激发成直角的方向上测量的。
大约 15% 的化合物具有天然荧光。共轭 π 电子，尤其是芳香族成分中的共轭 π 电子，会产生最强的荧光活性。此外，具有羰基的脂肪族和脂环族化合物以及具有高度共轭双键的化合物也会发光，但通常程度较低。大多数未取代的芳香烃都会发出荧光，量子产率随着环数、缩合度和结构刚性的增加而增加。荧光强度取决于激发和发射波长，允许选择性地检测某些成分，同时抑制其他成分的发射。任何成分的检测都很大程度上取决于所选波长，如果一个成分可以在 280 ex 和 340 em. 处被检测到，则另一个成分可能会被漏掉。大多数现代探测器允许快速切换激发和发射波长，这提供了检测混合物中所有成分的可能性。例如，在非常重要的多环芳烃色谱图中，前 6 个成分的激发和发射波长分别为 280 和 340 纳米，然后更改为 305 和 430 纳米的相应值；后者的值代表了允许灵敏检测化合物的最佳折衷方案。
荧光蛋白
[edit | edit source]荧光蛋白是我们用于荧光检测以标记 DNA 的工具。在荧光蛋白中，荧光团通常是由三个氨基酸形成的双环结构。它被称为β桶，因为它是由 11 条β折叠片组成，并在顶部和底部有额外的氨基酸序列闭合。它们通常可以附着到其他蛋白质而不改变其他蛋白质的结构或功能。因此，它经常被用于实验室标记和检测分子、细胞和生物体。它也被用于药物筛选、评估用于人类基因治疗的病毒载体、监测环境中基因修饰的微生物以及生物防治。
绿色荧光蛋白 (GFP) 在一种名为维多利亚多管水母 (Aequorea victoria) 的水母物种中存在了超过一亿六千万年。这种蛋白质存在于维多利亚多管水母的光器官中。GFP 不是水母照片中经常看到的辉光的来源——那种“荧光”实际上是由于用于拍摄水母的闪光反射造成的。
由于荧光蛋白独特的β桶折叠，整个蛋白质中残基的突变有可能显着改变其荧光特性。正如海报中所强调的那样，这种突变最显著的结果是目前可用的各种不同发射颜色，这大大提高了这些蛋白质作为分子探针的用途。然而，大多数单点突变对 FP β桶的紧密堆积有负面影响，因此导致环境敏感性增强和亮度降低。虽然一些缺陷可以通过额外的突变来弥补，但衍生的 FP 与原始蛋白质相比，通常亮度较低和/或对环境更敏感。这种现象在寻找四聚体红色荧光蛋白的真正单体版本的过程中尤为明显，该蛋白质来自珊瑚 Discosoma sp。
测序方法
[edit | edit source]随着时间的推移，已经开发出大量测序方法，下面列出了其中一些方法及其简要描述。
焦磷酸测序
[edit | edit source]焦磷酸测序是由 Pål Nyrén 和 Mostafa Ronaghi 于 1996 年在斯德哥尔摩皇家理工学院开发的。测序过程是通过酶促合成 DNA 的互补单链来完成的。碱基 A、T、G 和 C 在过程中依次添加和移除。当 DNA 聚合酶添加到单链中时，ATP 硫酸酶会产生 ATP，ATP 硫酸酶被荧光素酶用于产生光。然后检测并记录该碱基的光强度。如果添加了一个碱基但没有产生光，则添加了错误的碱基来进一步进行测序。该过程重复多次，直到 DNA 的整个链被完全合成和测序。
桑格测序
[edit | edit source]桑格测序方法诞生于 1974 年，其最基本原理是使用链终止剂，以与该位点模板互补的引物为起点，延伸 DNA 模板的特定位点。该方法使用放射自显影，使用 DNA 聚合酶、四个 DNA 碱基、引物和链终止核苷酸，导致产生不同大小的 DNA 片段；其大小取决于使用该特定核苷酸的位置。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 根据片段大小对片段进行分离。一种更简单的方法是使用荧光染料终止剂测序，其中必须使用荧光染料标记链终止剂。每个链终止剂用不同的彩色染料标记。进行 PAGE，并在一次反应后识别所有链终止剂，而不是之前提到的标记引物方法中所需的四次反应。然而，桑格 DNA 测序方法存在一些问题，因为凝胶制备需要大量时间和人工，而且需要大量样品。在测序之前，必须将 DNA 变性为单链，并且必须将引物连接到模板链上，模板链以其 3' 端位于所需 DNA 片段的旁边创建。它们通过放射性 (放射自显影) 或荧光进行标记。然后将溶液分成 4 个容器，然后在其中添加四种试剂中的一种：ddAPT、ddTPT、ddCTP、DDGTP，以及 DNA 聚合酶和所有四个 dNTP。该方法之所以有效，是因为所有反应都从同一个核苷酸开始，并以所需的碱基结束。因此，新链会在每个可以添加核苷酸的位置终止，从而产生不同长度的条带。在此之后，DNA 再次变性并通过电泳进行分离，然后将分组容器中的内容物在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，以将条带彼此分离。
由于大型片段难以测序，因此有必要使用小片段进行工作。**弗雷德里克·桑格**设计了一种控制复制终止的方法。在这项极其简单的技术中，使用 2',3'-脱氧核苷酸类似物来启动链终止。每个反应管都包含 A、G、T 和 C 脱氧核苷酸类似物以及常规放射性标记的 dNTP。在控制复制终止后，将每个反应组在一个电泳凝胶的单个泳道中进行。由于复制在随机掺入脱氧核苷酸类似物后终止，因此最短的片段（运行距离最远）是序列中的第一组碱基。
DNA 分析的未来
[edit | edit source]基因组测序将极大地促进我们对遗传生物学的理解，并在医学诊断和治疗方面具有巨大潜力。一个障碍是基因组测序的成本（第一个人类基因组图谱是在 2003 年绘制的，据估计花费了 30 亿美元）。纳米孔设备可能会将此成本降低到几百美元，从而使个人基因组测序对每个人都可用。在 1990 年代中期，来自加州大学圣克鲁兹分校的戴维·迪默设想了将 DNA 穿过一个微小孔 (纳米孔) 的想法。
纳米孔是一个微小的孔，DNA 分子可以穿过并被读取。目前，纳米孔 DNA 分析方法涉及将蛋白质插入脂质膜中。当施加电压时，DNA 分子可以被拖过纳米孔。这种方法的主要缺点是脂质膜非常脆弱。
来自代尔夫特理工大学和牛津大学的研究人员提出了一种新的方法，该方法结合了人工和生物材料，在芯片上创建纳米孔，可以分析单个 DNA 分子。该方法涉及将单个蛋白质连接到较大的 DNA 片段上，然后将其穿过硅氮化物膜上的预制开口。
然而，硅氮化物材料有点太厚，因此一个以上的核苷酸可能同时进入孔中。来自代尔夫特、宾夕法尼亚和哈佛大学的研究人员正在使用石墨烯（单原子厚度的碳片），并已将 DNA 穿过钻入石墨烯的纳米孔。石墨烯可能是基因组测序的未来，因为它坚固、薄且具有良好的导电性。
单分子测序是一种快速、低成本的直接测序DNA或RNA分子方法，它可以对许多单链DNA进行多次测序。将标记有荧光指示剂的标记dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和DNA聚合酶添加到作为DNA模板的流动池中，并开始互补。单分子测序仪可以纠正测序过程中的错误。洗涤步骤用于去除过量的核苷酸。剩余的核苷酸被捕获并分析。
这指的是一整类测序方法。通常用于查找已知DNA序列中的微小变化，它对单碱基错配敏感。在其中，将SBH芯片上的短核苷酸序列插入到所需DNA序列的溶液中。然后，探针（或具有特定序列的单个DNA片段）绑定找到的序列，并用于找到整个序列。这种方法的问题是，必须找到最少的探针数量才能测序最多的DNA。这项技术最早于1988年提出，并于1991年用于重建一个100个碱基对的DNA序列。大体上分为两个步骤，第一步是将DNA与微阵列杂交，第二步是将它们结合起来并从一组k-mer中通过算法重建它们。
这种方法一次可以测序大约100个碱基对，但其分辨率还需要改进。MALDI和ESI是最常用的电离方法，其竞争优势在于它可以在几个小时内完成，而不是像其他方法那样需要几天。质谱测序的优势在于可以识别移码突变和杂合突变。与其他方法（如Sanger测序）不同，可以确定长度相同但DNA组成不同的DNA片段。可以对这些DNA测序片段进行MALDI-TOF MS，并且可以非常准确地确定碱基。
这种方法使用电子显微镜扫描DNA表面，并获得被研究片段的纳米级分辨率。这只需要极少量的DNA，大约几纳克。使用这种方法，可以分析不同类型的DNA片段，例如超螺旋、线性或松弛DNA。它的一个优势是不需要使用染色剂或放射性试剂，因此对被测序的片段造成的损伤较小。它还提供了3D图像而不是2D图像。
这种方法由GNN总裁J. Craig Venter于1996年创立，它依赖于从基因组中分离出随机的DNA片段，然后进行多次分离以获得冗余拷贝。然后，通过它们重叠的区域将增加的DNA片段组装起来，形成一个连续的转录本，通常使用计算机完成。最后，定制引物描述了这些转录本之间的间隙，从而给出测序的基因组。这种方法可以实现更快的测序，例如用于查找天花的基因组。全基因组鸟枪法测序分几个步骤进行。首先，将DNA再次分离成随机片段，然后克隆到合适的载体中。首先分离DNA，然后通过搅拌机、窄口注射器或超声处理将其剪切成几个片段，通常每个片段大约2,000个碱基对。然后将这种DNA加载到凝胶中，并与已加载的标记DNA进行比较。然后回收指定DNA并连接到克隆载体中，从而扩增所需的DNA序列。然后将序列两侧的引物退火并通过测序仪进行分析。然后，所有序列（通常为500个碱基对）通过复杂的计算机算法进行比较，并找到最大的可能的连续片段，然后将整个基因组拼凑起来。这种方法最普遍的批评是它不够准确，然而，在2000年，Celera成功地测序了果蝇的基因组。
这种类型的测序被用于人类基因组计划。它比鸟枪法慢得多，但它是一种更可靠的测序方法。它从首先创建人类基因组图谱开始，然后再进行测序。将人类染色体剪切成片段，然后在实际测序开始之前先确定这些片段的顺序。首先，将基因组剪切成150kb长的片段。然后，将这些150kb片段插入BAC中，BAC是一种人工细菌染色体。这些片段构成BAC文库，就像一个真正的图书馆一样。因此，每个BAC片段就像一本书，可以从图书馆中选择。下一步是对片段进行指纹识别，方法是用酶将BAC片段剪切成更小的片段。找到重叠部分中的共同序列将能够确定BAC在每条染色体上的位置。这使得研究人员能够确定它们沿着染色体的片段顺序。下一步是将BAC分解成更小的片段，大约1.5kb长，然后插入人工DNA中。这种DNA被称为M13，这些片段构成M13文库，就像BAC文库一样。然后对M13文库进行测序，并将所有片段组合起来以找到顺序。这通常由计算机完成，因为测序非常复杂。与鸟枪法测序相比，BAC测序需要更长的时间，并且对于更大的基因组更有用。
这种方法用于检查DNA样本中是否存在特定的DNA。它使用琼脂糖凝胶电泳以及将分离的DNA转移到滤膜上进行探针杂交的方法。首先，限制性内切酶将DNA剪切成小片段，然后将这些片段在琼脂糖凝胶上进行电泳。接下来，可以将DNA分解成合适的小片段，然后在碱性溶液中变性。接下来，将一张硝酸纤维素膜放在凝胶上，施加均匀的压力。然后将其置于高温烘箱中或暴露在紫外线照射下，以利用DNA与膜之间的共价交联。在此之后，将标记的杂交探针放入膜中，然后洗掉，并在X射线胶片上通过放射自显影找到图案。P-32 ATP是允许放射自显影的探针。
DNA测序的另一种方法是**染料终止子测序法**。这种方法可以在一个反应中完成，这非常有利。使用这种方法，四种双脱氧核苷酸链终止子中的每一种都用不同的荧光染料标记，这些染料在不同的波长下发出荧光。然后可以使用带控制序列分析仪的计算机完成测序。这种方法的一个问题是，电子DNA序列追踪色谱图中可能存在峰高和峰形不一致的情况。然而，解决这个问题的方法是使用新的DNA聚合酶和染料，这些酶和染料可以限制变异性和染料斑点。这种测序方法非常常用，尤其是在它比其他方法更快且成本更低的情况下。
Sanger双脱氧方法用于测序DNA。这个过程快速简单，涉及使用DNA聚合酶合成一个互补序列，该序列包含在四个脱氧核糖核苷酸碱基上的荧光标签。然后通过电泳或色谱法分离包含荧光碱基的DNA链片段，然后将其送入检测器。测序基因组DNA的另一种方法是鸟枪法。
艾德曼降解法用于测定蛋白质的序列。苯异硫氰酸酯与N端氨基酸中的氨基反应，然后酸化将其移除。高效液相色谱法（HPLC）用于鉴定氨基酸。对每个后续蛋白质重复该过程。
DNA测序中蛋白质阵列的顺序组装和重组是必要的，因为它是协调执行DNA复制的起始、延伸和终止过程的关键。该过程的生理意义表明，与复制叉的组装和监测相关的蛋白质缺陷会导致基因组不稳定，这可能进一步导致癌变。它也可能导致一系列被称为“染色体不稳定综合征”的疾病。
真核细胞中DNA复制的一个关键特征是它具有高度适应性或可塑性。这种可塑性和适应能力体现在叉速率和复制起点选择过程相互调节，以及当叉子停滞时非活性复制起点被激活。在复制过程中，DNA解旋酶完成复制，DNA聚合酶延伸DNA链。
DNA复制过程中的错误或缺陷通常会导致有害影响，例如基因组不稳定。这种类型的错误会导致突变和疾病，例如癌症，其表现为异常组织生长，并且还可能导致被称为“染色体不稳定综合征”的一组疾病。
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