结构生物化学/DNA重组技术

概述

在许多生物化学研究领域，获取足够数量的研究物质是一个挑战。例如，从10 L培养的大肠杆菌中，最多只能获得7 mg的DNA聚合酶I，培养基中大肠杆菌的最高稀释度约为10^10细胞*mL^-1，但仍然存在其他蛋白质，产量更低。DNA重组技术，也称为基因工程和分子克隆，允许科学家操纵、复制和应用DNA进行研究。删除、插入和替换是为合成新基因而实施的最有用的改变。此类技术通常包括克隆或扩增序列以供进一步研究。限制性内切酶和DNA连接酶在重组DNA的生产中起着至关重要的作用。聚合酶链式反应（PCR）常用于感兴趣的序列，使其被核酸酶切割，然后被噬菌体、BAC或YAC克隆。使用DNA或RNA探针，可以从基因组文库中克隆特定的基因。DNA重组技术的根本思想是将一段DNA片段插入到一个复制的DNA分子中，该分子也称为克隆载体或运载体，因此DNA片段与载体一起复制。使用各种重组技术可以使科学家对DNA如何影响我们和其他生物体有新的理解。本节描述了基因工程中涉及的各种技术及其在生物化学中进行的许多实验中的应用。

克隆载体

载体是可以用来将DNA序列插入细胞的DNA分子。载体用于复制。实验室中常用的载体有质粒、病毒（λ噬菌体）和人工染色体。载体必须能够被细胞复制。

基于质粒的克隆载体

质粒是双链的，通常是环状的。它们预先具有遗传物质，如复制起点（DNA复制开始的地方），以便在细菌宿主或酵母中独立复制。虽然质粒可能作为寄生虫起作用，但它们在抗生素抗性等方面是有益的。

一方面，一些质粒在细胞中的数量为一到两个，并且每个细胞分裂复制一次，并且已知处于严格控制之下。另一方面，大多数用于基因工程的质粒处于松弛控制之下，在细胞中可以存在少至10个多达700个质粒拷贝。此外，当蛋白质合成由于抗生素的抑制而停止时，细胞分裂也停止，这些质粒可以在细胞中复制多达3000个拷贝。从基因工程合成的质粒类型处于松弛控制之下，并且包含对抗生素有抗性的基因，同时携带内切酶位点。这些内切酶位点有助于插入需要复制的DNA。多克隆位点或多克隆位点是DNA的一小段，其中有一系列在质粒的其他任何地方都找不到的限制性位点。pUC18（“质粒通用克隆”）是大肠杆菌中常用的载体。以下链接提供了更多信息和pUC18的示意图。

1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen展示了DNA克隆中第一个基因混合质粒。当宿主细菌与质粒混合时，最佳条件是在施加二价阳离子（如钙）和加热至约42摄氏度时。这种条件使细胞膜更容易渗透DNA，并被称为转化感受态。一旦质粒载体被吸收，它就会永久地建立在细菌宿主中，效率仅为约0.1%。质粒载体无法用于复制超过一定大小的DNA，因为质粒复制所需的时间与质粒大小成正比。

基于病毒的克隆载体

另一种克隆更大尺寸DNA的方法是使用一种名为λ噬菌体的克隆载体。病毒基因组空间的中间三分之一可以被更大尺寸的DNA插入，因为该区域在噬菌体感染过程中不是必需的。体外方法可以通过噬菌体感染宿主细胞来帮助插入嵌合噬菌体DNA。利用噬菌体作为克隆载体具有以下优点：嵌合DNA可以大量制备并易于纯化。此外，科学家可以利用λ噬菌体进行更长的DNA插入。允许病毒工具将DNA插入噬菌体头部所需的唯一条件是在每端都有一个称为cos位点的16-bp序列。这些末端需要至少相距36-51 kb，并且体外两个cos位点的组合会产生cosmid载体。Cosmid没有噬菌体基因，因此可以产生质粒。以下链接是一个λ噬菌体的卡通图片及其重要特征标签。

M13-丝状噬菌体是另一种克隆载体，它是在蛋白质管中呈单链和环状的DNA。相同螺旋蛋白亚基的数量取决于被包被的噬菌体DNA的长度，但通常约为2700个亚基。当在非必需区域插入外源DNA时，会产生更长的噬菌体分子单元。尽管M13不能维持大于1kb的DNA插入片段，但噬菌体直接产生某些技术所需的单链DNA。此[[1]]展示了M13的外观可视化。

另一种基于病毒的克隆方法是杆状病毒，它是一系列感染昆虫但不感染脊椎动物的大型病原病毒，从而易于在实验室中培养。与其他病毒一样，形成病毒基因组的双链DNA的一部分对于病毒复制并不重要，可以被外源DNA替换，最多可达15kb。此链接是杆状病毒的电子显微照片。

YAC和BAC载体

为了适应比cosmid携带的DNA片段更大的片段，使用了酵母人工染色体（YAC）和细菌人工染色体（BAC）。YAC包含酵母复制所需的所有分子必需品，例如复制起点、自主复制序列（ARS）、着丝粒和[[2]]。BAC在大肠杆菌中复制，并且来自通常复制长DNA片段的质粒。BAC载体具有自我复制、拷贝数控制和细胞分裂期间调控的质粒分离所需的最低限度的序列。以下链接是YAC图和[图]。

基因操作

在克隆DNA时，可以通过限制性内切酶获取特定序列的片段。通常，限制性内切酶会在DNA双链的特定位点切割，产生互补的单链末端。1972年，Janet Mertz和Ron Davis证明，限制性片段可以通过相同的限制性酶插入克隆载体中的切口。两种DNA的互补末端在DNA连接酶的帮助下共价连接。DNA插入片段可以通过用相同的限制性酶切割克隆载体来提取，从而形成嵌合载体。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是一种由Dale Kaiser和Paul Berg开发的技术，他们发现如果外源DNA和克隆载体没有共同的限制性位点，它们也可以被连接，并且可以进行此过程。该酶将核苷酸添加到DNA链的3'-末端OH基团上，它是唯一已知的无需模板的DNA聚合酶。此外，克隆载体通过酶在特定位点切割，并且3'末端用poly(dA)尾巴延伸。最后，将同聚物尾巴加热然后冷却，并用DNA聚合酶I填充由于与另一条链差异而产生的任何间隙，然后DNA连接酶将两者连接在一起。

与其他技术相比，基因操作去除了用于产生外源DNA插入的限制性位点。因此，很难从克隆载体中回收插入片段。然而，可以通过将与克隆载体的限制性位点匹配的化学合成的接头与外源DNA的两端连接来防止此问题。粘合是通过使用T4 DNA连接酶进行的，然后用限制性酶切割。可以查看使用末端转移酶拼接DNA的示意图。

需要选择转化的细胞

由于转化效率低和嵌合载体的构建困难，选择被载体转化的宿主细胞很困难。因此，在质粒转化中，使用抗生素或产色底物的双重筛选。例如，pUC18质粒包含lacZ'，因为lacZ'基因编码β-半乳糖苷酶。该基因引发从β-D-半乳糖的糖O1到取代基的键的水解。因此，当在5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（简称X-gal）中生长并水解时，无色物质会变成蓝色。可能出现两种不同的情况：当大肠杆菌被未修饰的pUC18质粒转化时，形成蓝色菌落；当大肠杆菌被包含在外源DNA插入片段的pUC18质粒转化时，由于插入片段与lacZ'基因的编码序列冲突，则呈无色。添加氨苄青霉素可以排除在添加X-gal时通常会变成无色的细菌。这是因为有颜色的细菌的抗性基因amp^R完整。这些amp^R基因被称为筛选标记。一些基因工程改造的λ噬菌体具有位于噬菌体基因组可用中心三分之一部分边界的限制性位点，并且该片段可以通过DNA插入片段替换。无法获得外源DNA的λ噬菌体太短，因此无法成为感染性噬菌体。特别是，由于在随机缺失过程中丢失了DNA并且未恢复，因此cosmid可以支持更大DNA插入片段的构建。

质粒载体

质粒是存在于细菌中天然存在的环状DNA片段。质粒可用作载体，通过将感兴趣的DNA插入片段连接到质粒DNA中，从而整合和复制该DNA插入片段。通过用限制性酶（如EcoRI）处理载体，使其在特定位点切割并留下互补的单链“粘性末端”，从而制备接受DNA插入片段的载体。待插入的DNA片段用相同的限制性酶处理，使其具有与载体互补的末端。然后使用DNA连接酶将DNA插入片段连接到载体质粒中，从而导致重组。当细菌宿主菌落生长时，重组质粒DNA可以克隆和扩增。

重组DNA技术中使用的酶

1. II型限制性内切酶总是识别回文序列，并且能够切割DNA链。换句话说，它们断裂DNA中特定碱基序列的磷酸二酯键。
2. DNA连接酶与II型限制性内切酶相反，它将两个DNA分子或片段连接在一起。
3. DNA聚合酶是一种能够利用模板DNA并通过在3'末端添加核苷酸合成互补链的酶。
4. 逆转录酶是一种从RNA分子创建DNA的酶。逆转录酶与RNA聚合酶相反，RNA聚合酶从DNA生成RNA。
5. 多核苷酸激酶在多核苷酸的5'-OH末端添加磷酸基团。它可用于放射性标记DNA或允许连接。 6. Voet, Donald, Judith G. Voet. Biochemistry 3rd ed. 新泽西州：John Wiley & Sons, Inc, 2004. 打印版。