结构生物化学/DNA重组技术/DNA合成
DNA可以通过自动化固相技术合成，就像合成多肽一样。将单体连接到不溶性柱上，然后按照感兴趣的序列顺序添加活化的单体，形成寡核苷酸。活化的单体是脱氧核苷3'-磷酰胺。活化意味着反应性基团，第五碳 (5') 上的羟基被DMT（二甲氧基三苯甲基）取代。它使脱氧核苷3'-磷酰胺分子远离5'上任何进一步的反应。因此，它被称为保护基团。3'-磷酰基团被β-氰乙基 (βCE) 基团保护。由于它是连接到不溶性载体的3'-磷酰基团，因此链是在3'到5'*方向上合成的。寡核苷酸的合成包括三个基本步骤。
- 3' 到 5'，意味着 5'羟基对进入单体的 3'-磷酰胺进行亲核攻击。这与天然DNA和RNA的正常5'到3'合成不同，在天然DNA和RNA中，3'羟基攻击5'三磷酸的最内侧磷原子。
第一步：该程序从脱氧核苷3'-磷酰胺（已经添加了DMT来保护5'，并且添加了βCE来保护3'-磷酰基）与正在生长的链反应，通过偶联形成磷酸三酯基团开始。这种偶联反应是由要添加的核苷的5'碳上的亲核羟基基团攻击现有链上的亲电磷原子驱动的，-NR2（通常是二异丙胺，一种相对稳定的仲胺）作为离去基团。该反应在无水环境中进行，以防止水水解3'-磷酰胺，导致反应意外逆转。并防止水与进入单体的3'-磷酰胺发生反应。一旦水攻击了3'-磷酰胺，它就不再能够接受正在生长的链的5'OH的亲核攻击。
第二步：使用碘，I2，将磷酸三酯基团氧化为磷酸三酯基团。
第三步：通过添加二氯乙酸（DCA，CHCl2COOH）去除活化单体5'侧的DMT基团，而其余分子保持不变。
寡核苷酸现在通过一个单体单元延长，并准备与另一个进入的活化单体反应。当合成所需的长度的寡核苷酸时，可以通过添加氨 (NH3) 来去除所有保护基团，并将产物从不溶性载体上移除。因为没有合成是完美的，并非所有生长的寡核苷酸每次都会与添加的单体反应。一些寡核苷酸将比其他寡核苷酸短，因为一些核苷酸丢失了。因此，这被认为是杂质，因为它们没有我们想要的精确序列携带精确的基因。最终产品是那些最长的。可以通过凝胶电泳分离新合成的寡核苷酸的混合物，以获得最初感兴趣的所需产物。
完成所有合成步骤后，将产物混合物置于浓缩氢氧化铵，NH4OH中，在室温下放置一小时。接下来，将含有氢氧化铵的混合物置于冰浴中，然后转移到带有螺帽的瓶中。为了去除杂环碱保护基团，将瓶中的溶液在55 oC下加热过夜。第二天，将溶液在冰浴中冷却，并蒸发至干燥。
可以使用四种方法来分析合成的DNA。
1. 高压（性能）液相色谱（HPLC）。
高效液相色谱是一种用于识别或分离化合物的技术。它包括两种基本形式，反相和离子交换。HPLC的分离和分析基于固定相（色谱填料）和流动相（需要识别或分离的化合物）在色谱柱中的保留时间。
离子交换HPLC基于固定相和流动相之间的电荷。与固定相具有相同电荷的化合物具有较短的保留时间，而与固定相具有相反电荷的化合物具有较长的保留时间。它用于长度为10至20个核苷酸的寡核苷酸。两组离子交换HPLC用于分析DNA。一个条件是使用20mM Tris缓冲液/0.05%乙腈和1M NaCl，以1.5 mL/min的速度洗脱的dNAPac色谱柱。另一个条件是使用10mM NaOH/80mM NaBr和10mM NaOH/1.5M NaBr，以1.5mL/min的速度洗脱的Resource-Q色谱柱。
反相HPLC基于固定相和流动相之间的亲和力。反相HPLC的固定相是非极性的，非极性化合物比极性化合物具有更长的保留时间。
2. 凝胶电泳
凝胶电泳是一种用于分离DNA、RNA或蛋白质分子的技术。对于寡核苷酸，使用15~20%交联凝胶，含有7M尿素。凝胶电泳在50到60 oC下进行3~6个小时。为了观察寡核苷酸，使用分子动力学磷光成像仪。
凝胶电泳可用于分析合成的DNA。它也用于合成DNA的纯化。较长的合成DNA主要用于克隆和杂交。在寡核苷酸合成过程中形成的非全长合成DNA可能会干扰应用，因此纯化很重要。凝胶电泳是一种有效分离全长产物与其他较短产物的技术。
3. MALDI-TOF分析
MALDI-TOF是一种质谱中的电离技术。它通过化合物的质量来识别化合物，例如寡核苷酸。寡核苷酸在MALDI仪器的离子室中被电离并赋予势能。然后寡核苷酸通过将势能转换为动能来移动到MALDI仪器的检测器。E=1/2mv2。由于E（能量）是给定的，v（速度）是测量的，因此可以确定核苷酸的m（质量）并将其与它应该具有的值进行比较。
4. 寡聚体的酶促降解
将产物溶解在蛇毒磷酸二酯酶、碱性磷酸酶和缓冲溶液的混合溶液中。反应在37 oC下进行4个小时。之后，将混合物加热以变性酶。然后用水分散混合物并离心。最后，通过HPLC分析混合物。
固相合成寡核苷酸的优点与合成多肽的优点类似。由于生长的核苷酸连接到不溶性载体上，因此所有可溶性杂质都可以被洗掉，而不会损失任何产物。
能够合成具有精确序列的寡核苷酸具有重要的用途。合成的寡核苷酸可以用于许多DNA操作技术。
1. DNA序列
如果已知基因序列，则可以使用带有荧光标记的合成寡核苷酸来定位非常长的DNA分子中的基因。因为我们将能够合成一种新的寡核苷酸，它与我们要定位的基因序列互补。用作探针的标记寡核苷酸在探索新基因方面非常重要。该探针可以用作引物，通过尚未绘制的DNA聚合酶启动邻近DNA的复制。利用探针的荧光能力，我们能够确定我们要定位的新基因从哪里开始。
2. 聚合酶链式反应 (PCR)
聚合酶链式反应（PCR）是一种扩增特定DNA片段的技术。为了扩增特定的DNA序列，需要一对与目标DNA序列杂交的引物、四种脱氧核苷三磷酸和一种耐热DNA聚合酶。用于杂交目标DNA序列的特定引物可以通过寡核苷酸合成技术制备。
3. **定点诱变**
定点诱变或寡核苷酸定向诱变可以产生具有单个氨基酸替换的突变蛋白。该技术的关键是制备一个与DNA互补的寡核苷酸引物，除了想要改变氨基酸的区域以外。在适当的温度下，15个碱基中1个碱基的引物错配是可以容忍的。这些特定的寡核苷酸引物可以通过寡核苷酸合成技术制备。
4. **大规模合成**
寡核苷酸的大规模合成与上述过程基本相同，只是使用了一种不同的柱子。大规模合成使用的是填充柱，而不是松散填充的柱。
5. **在平面玻璃表面上制备DNA微阵列**
DNA微阵列或基因芯片可以用来分析特定细胞或组织中所有基因的表达模式和水平。该技术可以通过将寡核苷酸放置在平面玻璃表面上实现。探针（寡核苷酸）在硅芯片上合成。将薄的硅橡胶毛细管放在玻璃载玻片上，并合成探针。用荧光标记的互补DNA与由寡核苷酸制成的基因芯片杂交。这种杂交的基因芯片显示了每个基因的表达水平。
6. **Southern印迹**
Southern印迹是一种鉴定DNA分子的技术。为了鉴定具有特定序列的DNA片段，需要一个32P标记的单链DNA探针，即通过寡核苷酸合成制备的特定DNA分子。探针与DNA样本的互补序列杂交。然后，可以通过放射自显影法观察到特定序列。