结构生物化学/DNA重组技术/电穿孔

概述

电穿孔可用于将基因插入真核细胞，如植物细胞和动物细胞，以及原核细胞，如细菌细胞。在电穿孔中，可以通过施加强电场将外源 DNA 导入禾本科单子叶植物和双子叶植物。

程序

以植物细胞为例。首先，植物细胞将包含细胞壁和质膜。纤维素用于消化细胞壁，创造一个具有暴露膜的植物细胞。这被称为原生质体。其次，将外源 DNA 添加到细胞中。高电场用于产生短暂的渗透性膜，以便大分子能够穿过膜。这是由瞬态电脉冲引起的。第三，细胞壁能够重新生长。最后，植物细胞现在是一个具有外源 DNA 插入的可行植物细胞。

优化考量

当进行体外电穿孔时，必须考虑几个因素。

• 波形 - 当电穿孔技术最初开发时，使用指数脉冲。从那时起，发现方波对细胞更有效且损伤更小。脉冲长度和幅度可以根据实验者的需要进行修改。
• 细胞大小 - 跨膜电位由方程 ΔV(m) = fE(ext)r cosθ 描述，其中 V(m) 是跨膜电位，f 是将外部场与其对细胞的影响相关的比例常数，E(ext) 是外部施加的电场，r 是细胞半径，θ 是场相对于细胞极的角度。这意味着细胞越小，必须施加的外部场越大才能达到相同的电穿孔效果。此外，更均匀的细胞采样将产生更好的电穿孔结果。
• 重新封闭 - 电穿孔后的膜重新封闭是温度依赖性的，较低的温度与较慢的重新封闭时间相关。培养箱通常会提高结果的质量。电穿孔后等待 15 分钟再通过移液来干扰细胞可以改善结果，因为这可以让细胞重新封闭。使用表面活性剂泊洛沙姆 118 也可以提高重新封闭速率，以获得更好的结果。极强的脉冲会导致不可逆的通透性。
• 金属电极 - 对于较长的脉冲，一次性比色皿中电极释放铝金属是一个问题；有时建议使用低电导率金属。
• 脉冲介质中的金属 - 一般来说，脉冲介质中要避免使用钙，因为它会扰乱该离子的细胞内水平。但是，介质中的钙或镁通常推荐用于 DNA 转移。

重要性

电穿孔通常用于分子生物学中将物质导入细胞。这可以通过将分子探针加载到细胞中的物质、通过编码 DNA 片段或通过能够改变细胞功能的药物来完成。在尝试将外源基因导入组织培养细胞时，电穿孔效率很高。例如哺乳动物细胞。该过程用于生产基因敲除小鼠。电穿孔是有益的，因为它可以用于治疗肿瘤，以及细胞治疗和基因治疗。这被称为转染，它是将外源 DNA 导入真核细胞的过程。