结构生物化学/DNA重组技术/Northern印迹
Northern印迹，也称为RNA印迹，是用于将DNA和RNA转移到载体上进行分类和识别的印迹技术之一。Northern印迹类似于Southern印迹，不同之处在于该技术分析的是RNA而不是DNA。首先，必须纯化来自每个组织的RNA，以便可以检查其基因表达。然后，将RNA样品加载到琼脂糖凝胶上。然后使凝胶经受电流，导致每个样品中的RNA迁移到凝胶的底部。较小的RNA移动得更快，而较大的RNA移动得更慢。这种分离过程称为电泳。然后将分离的RNA片段印迹到特殊的滤纸上，以便每个RNA分子保留其相对于所有其他分子的位置。然后将过滤器暴露于放射性探针，这些探针与印迹中互补的序列杂交。然后将过滤器放置在薄膜上进行放射自显影，并显影薄膜。最后，如果探针与过滤器上的RNA片段杂交，则应在放射自显影图上观察到一条带。只有在包含表达探针所代表基因的组织的柱中才能看到一条带。
Northern印迹对于以两种方式研究基因表达很有用。首先，印迹上条带的位置直接衡量了RNA的大小。了解RNA的大小将为转录本的编码能力提供估计，从而为它编码的蛋白质的大小提供估计。其次，对来自许多不同组织的RNA样品进行Northern印迹分析使研究人员能够确定某个基因在哪个特定组织中表达，以及其在所有发生转录的细胞中的相对表达水平。Northern印迹是研究人员确定基因表达模式的宝贵方法。例如，许多研究亨廷顿舞蹈症或乳腺癌的科学家能够使用印迹技术确定导致这些疾病的基因的表达模式。三种印迹技术，包括Northern印迹，已被证明是科学中的重要且积极的进步。
Northern印迹 是 Southern印迹 的衍生物，它与Southern印迹一样，利用电泳分离分析和杂交探针进行检测。对于这两种技术，用于检测的杂交探针可以由DNA或RNA制成。两种技术之间的主要区别在于Northern印迹用于通过分析RNA而不是DNA来研究基因表达。RNA有三种类型：tRNA（转运RNA - 在多肽链组装中起作用）、rRNA（核糖体RNA - 核糖体结构的一部分）和mRNA（信使RNA - DNA转录的产物，用于将基因翻译成蛋白质）。正是mRNA被分离并在Northern印迹中杂交。甲醛在电泳凝胶中用作变性剂，因为Southern印迹程序中使用的氢氧化钠处理会降解RNA。Northern印迹是由詹姆斯·阿尔温、大卫·肯普和乔治·斯塔克在1977年在斯坦福大学开发的。
Northern印迹的步骤如下：
1) RNA分离：从细胞中提取并纯化mRNA。
2) 探针生成：将mRNA加载到凝胶上进行电泳。泳道1有大小标准（已知RNA片段的混合物），泳道2有RNA。
3) 变性琼脂糖凝胶电泳：电流通过凝胶，RNA从负电极移动。移动的距离取决于RNA片段的大小。由于基因大小不同，mRNA的大小也随之变化。这导致凝胶上出现涂抹。标准用于量化大小。RNA可以通过首先用荧光染料染色，然后用紫外线照射来可视化。
4) 转移到固体载体上并固定：RNA是单链的，因此它可以无需任何进一步处理即可从凝胶中转移到膜上。转移可以通过电气方式或通过具有高盐溶液的毛细作用来完成。
5) 预杂交和与探针杂交：用针对所讨论的RNA片段的标记探针孵育印迹。洗涤印迹以去除非特异性结合的探针[检查拼写] 探针，然后进行显影步骤以可视化结合的探针。
6) 洗涤：探针特异性地结合到目标mRNA，并且几乎没有非特异性结合到其他mRNA或尼龙膜本身。
7) 检测：然后检测杂交信号。
8) 剥离和重新探测（可选）:
Northern印迹的这一部分是一个重要的步骤，因为需要获得高质量的完整RNA。分离可以以多种方式进行；然而，共同属性包括细胞裂解和膜破坏、核糖核酸酶活性的抑制、脱蛋白和完整RNA的回收。
虽然Southern印迹是以埃德温·萨瑟恩[1]的名字命名的，但令人难以置信的是，Northern印迹是由詹姆斯·阿尔温、大卫·肯普和乔治·斯塔克[2]开发的。“Northern印迹”这个名字仅仅是文字游戏。Southern、Northern和Western印迹分别以其对DNA、RNA和蛋白质的分析而闻名。
Western印迹使研究人员能够确定蛋白质的分子量，并测量不同样品中存在的蛋白质的相对量。
程序
a) 蛋白质通过凝胶电泳分离，通常使用SDS-PAGE使所有蛋白质带负电荷。
b) 然后将蛋白质转移到一张特殊的印迹纸上，称为硝酸纤维素纸，尽管可以使用其他类型的纸张或膜。蛋白质保留在它们之前在凝胶上分离的相同模式中。
c) 将印迹与通用蛋白质（例如牛奶蛋白）一起孵育，以结合硝酸纤维素上任何剩余的粘性部位。然后将一种抗体添加到溶液中，该抗体能够与其特异性蛋白质结合。抗体具有附着在上面的酶（例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）或染料，目前还看不到。
d) 通过将印迹与无色底物一起孵育来显示抗体的位点，附着在上面的酶将底物转化为有色产物，该产物可以观察到并拍照。
其他类似的技术，如远端Western印迹和南方Western印迹，分别使科学家能够检查蛋白质-蛋白质相互作用和DNA-蛋白质相互作用。
- ↑ Berg, Jeremy M. (2007). Biochemistry (第 6 版). W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-8724-5.
{{cite book}}:|edition=has extra text (help) - ↑ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "通过转移到重氮苯氧甲基纸和与DNA探针杂交来检测琼脂糖凝胶中特定RNA的方法". 美国国家科学院院刊. 74 (12): 5350–4. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMID 414220.
{{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
3. Ambion. 应用生物系统. http://www.ambion.com/techlib/basics/northerns/index.html