结构生物化学/DNA重组技术/质粒
质粒是细菌中自然存在的附属染色体 DNA。一些细菌细胞可能没有质粒，也可能有多个拷贝。它们可以独立于宿主染色体复制。质粒是环状的双链 DNA。它们携带的基因很少，大小范围从 1 到超过 200 千碱基对。其基因的一些功能包括：提供抗生素抗性、产生毒素和分解天然产物。然而，质粒并不局限于细菌；它们也存在于一些真核生物中（例如，粘菌属紫色粘菌中的环状核质粒）。
质粒是一种环状双链 DNA，通常存在于细菌中（但它确实存在于真核生物和原核生物中）。它可以自行复制（无需染色体 DNA 的帮助），并且经常用于重组 DNA 研究以复制感兴趣的基因。一些质粒可以植入细菌或动物染色体中，在那里它成为细胞基因组的一部分，然后将感兴趣的基因揭示为表型。这就是今天进行许多基因识别研究的方式。
质粒包含三个组成部分：复制起点、用于克隆感兴趣基因的多克隆位点（称为限制酶切割的多个克隆位点）和抗生素抗性基因（可选择标记）。
质粒在用于重组技术之前通常会被分离出来。碱性裂解是分离环状质粒 DNA 的首选方法。此过程快速可靠。首先获得具有感兴趣质粒的细胞，并用碱裂解它。然后，这一步接着提取质粒。使用 SDS 和醋酸钾沉淀细胞碎片。将这部分离心，并去除沉淀物（细胞/细胞碎片）。接下来，使用异丙醇从上清液中沉淀质粒 DNA。然后将质粒悬浮在缓冲液中。碱性裂解可以根据是微量、中量或大量制备，得到不同数量的质粒。
质粒可能与病毒有关，因为由于它们能够在其宿主内部自我复制，因此它们可以是独立的生命形式。尽管它们可能被视为独立的生命形式，但它们对宿主的依赖性很高。质粒及其宿主往往具有共生关系。质粒可以为其宿主提供必需的 DNA 包裹，携带可在艰难时期导致相互生存的基因。通过为其宿主提供这种遗传信息，质粒使宿主得以生存，同时使自己能够在宿主中生存几代。
质粒用作载体，在细菌中克隆 DNA。用于 DNA 克隆的质粒的一个例子称为 pBR322 质粒。pBR322 质粒包含一个基因，使细菌能够抵抗四环素和氨苄青霉素。为了使用 pBR322 质粒克隆基因，首先使用限制性内切酶在限制性位点切割质粒。pBR322 质粒包含三个限制性位点：PstI、SalI 和 EcoRI。前两个限制性位点分别位于编码氨苄青霉素和四环素抗性的基因内。在任一限制性位点切割将使它们各自的基因和抗生素抗性失活。靶 DNA 用与限制性位点相同的限制性内切酶切割。然后使用 DNA 连接酶将靶 DNA 退火到质粒。靶 DNA 被整合到质粒后，宿主细胞在含有氨苄青霉素或四环素的环境中生长，具体取决于哪个基因保持活性。一旦宿主能够复制，就会产生许多拷贝的靶 DNA。
另一种用作克隆 DNA 载体的质粒称为 pUC18 质粒。该质粒包含一个基因，使宿主细胞对氨苄青霉素具有抗性。它还包含一个基因，使其能够产生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶是一种降解某些糖的酶。当暴露于特定的底物类似物时，该酶会产生蓝色色素。这使得宿主易于识别。β-半乳糖苷酶基因包含一个多克隆位点区域，该区域包含多个限制性位点。pUC18 质粒可以被几种不同的限制性内切酶切割，这提供了更大的通用性。当多克隆位点序列被切割并引入目标 DNA 并连接起来时，这会使编码β-半乳糖苷酶的基因失活，并且该酶将不会被产生。当暴露于底物类似物时，宿主细胞不会产生蓝色色素。这使得重组细胞易于识别和分离。
克隆是一种重组基因的方法，以利用细菌的天然能力来重新创建质粒。工程质粒可用于克隆长达 10,000 个碱基对的遗传物质，遗传物质的数量受质粒大小的限制。由于细菌质粒中表达基因的重复，可以去除质粒的重复遗传物质并用所需性状替换它。大多数用于实验室使用的预先设计的质粒已经包含抗生素抗性基因、多克隆位点和复制起点。多克隆位点经过设计，允许多个独特的切割位点，这些切割位点将允许所需的 DNA 片段化。复制起点将模拟将用于克隆的细菌的遗传物质。
获得质粒后，将使用特定的核酸内切酶在多克隆位点上切割两个位点。然后，所需的 DNA 也将使用不同的核酸内切酶从不同的来源切割。切割的 DNA 有时会用聚合酶链式反应扩增。所需的 DNA 性状将被插入现在为空的多克隆位点。用所需的遗传性状替换多克隆位点称为盒式诱变。新创建的质粒将与细菌混合，然后对细菌进行热休克或电休克，以帮助质粒作为载体发挥作用。在允许细菌繁殖后，将提供工程质粒赋予抗性的抗生素。所有仍然存活的细菌都将获得插入的 DNA 和抗生素免疫力的所需性状。可以使用不同的方法收集插入 DNA 的新蛋白质或生化结构。
缺失发生在从 DNA 序列中删除一个或多个碱基对时。可以使用不同的限制性内切酶来切割出某个片段，然后使用 DNA 连接酶连接以重新形成新的、更小的质粒，从而可以从质粒中去除大量的 DNA。可以使用在粘性末端附近切割的多个限制性内切酶，然后连接，从而去除单个或少数碱基对。
替换是蛋白质序列中单个氨基酸发生改变的结果。这通常是通过改变遗传密码序列上的一个（点突变）或多个碱基对来实现的，以改变特定位点的氨基酸，被称为寡核苷酸定向诱变。寡核苷酸的设计使得在特定位点只有一个碱基对不同，并且这个不同的碱基对将编码新的残基。将寡核苷酸退火到质粒上，质粒充当 DNA 模板，使用 DNA 聚合酶复制导致包含该突变的链。复制的双螺旋 DNA 的一条链将是亲本链，包含原始（野生型）碱基序列，而另一条链将包含包含编码所需新蛋白质的新（突变体）DNA 链。通过表达突变链，可以收获所需的蛋白质。
插入发生在将整个 DNA 片段引入质粒时。该 DNA 片段被称为盒式，该技术被称为盒式诱变。使用限制性内切酶切割质粒，去除一部分 DNA。然后将特异性合成的或收获的 DNA 连接到该区域，并表达和研究质粒。
还可以通过将原本无关的基因连接在一起，来创建全新的蛋白质和基因。
分类方式
质粒对于宿主细胞的生存并非必需。它们携带能够为宿主提供选择性优势的基因，例如对其他生物体产生的天然抗生素的抗性。质粒产生的抗生素抗性基因将允许宿主细菌在存在产生这些抗生素的竞争性细菌的情况下生长。对质粒进行分类的一种方法是根据它们转移到其他细菌的能力。接合质粒保留 tra 基因，这些基因执行复杂的接合过程，即质粒向另一个细菌的转移。相反，非接合质粒无法启动接合，因此只能通过接合质粒转移。一类过渡性质粒被认为是可动员的，它们只包含成功转移所需基因的一个子集。它们有能力通过在质粒存在的情况下以高频率转移来寄生接合质粒。目前，质粒被用来操纵 DNA，并且可能被用作治疗疾病的工具。
Figure 1-1: Illustrates the process of bacterial conjugation.
一个细胞中可能存在多种质粒。在一个大肠杆菌中已经发现最多有七种不同的质粒共存。也可能发现不相容的同类质粒，由于重要质粒功能的调节，这些质粒中只有一种在细胞环境中存活。因此，质粒可以根据相容性被划分为不同的组。
按功能分类质粒另一种对质粒进行分类的方法是根据它们的功能。
总共有五个主要亚组。
生育质粒（F 质粒）- 携带接合的生育基因（tra 基因），即两个细胞之间遗传信息的传递。F 质粒也被称为附加体，因为它们整合到宿主染色体中并促进染色体 DNA 在细菌细胞中的转移。
Figure 1-2: Illustrates a fertility plasmid.
抗性质粒（R 质粒）- 包含编码对抗生素或毒素的抗性的基因。在 Berg 的 "生物化学" 第 5 章中发现的 R 质粒的例子包括以下内容。
pBR322 质粒pBR322 是最早用于克隆目的的质粒之一。它包含对四环素和氨苄青霉素的抗性基因。在特定限制位点插入 DNA 可以使四环素（称为插入失活效应）或氨苄青霉素抗性基因失活。
图 1-3：说明 pBR322 R 质粒
pUC18 质粒pUC18/pUC19 与 pBR322 相比具有更高的多功能性。与 pBR322 相似，pUC18 质粒具有复制起点和基于氨苄青霉素抗性的选择标记。此外，该质粒还包含一个 β-半乳糖苷酶基因，这种酶可以降解某些糖。在存在特定底物类似物的情况下，这种酶会产生蓝色色素，可以很容易地检测到。此外，该酶已被改造，因此它具有一个多克隆位点区域，在那里可以使用许多不同的限制酶或酶组合在不同的位置切割。为可以克隆的 DNA 片段创造更多样的可能性。有趣的是，DNA 片段的插入会使 β-半乳糖苷酶失活。因此，如果蓝色的色素没有生成，则表明 DNA 片段没有正确插入。pUC18 与 pUC19 相似，但 MCS 区域是反向的。
图 1-4：说明 pUC19 R 质粒
肿瘤诱导质粒（Ti 质粒 "毒力质粒"）- 包含农杆菌，它们携带细菌通过转变为肿瘤状态并合成冠瘿碱、毒素和其他毒力因子而成为病原体的指令。质粒有效地将外源基因转移到某些植物细胞中。Ti 质粒也可以在 Berg 的 "生物化学" 第 5 章中找到。
图 1-5：说明 Ti 质粒
降解质粒- （分解代谢质粒）一种能够使宿主细菌代谢通常难以或不寻常的有机化合物（例如杀虫剂）的质粒。
Col 质粒- 包含编码抗菌多肽（称为细菌素）的基因，细菌素是一种杀死其他菌株细菌的蛋白质。大肠杆菌的 Col 蛋白由 Col E1 等蛋白质编码。
质粒可能属于上述质粒亚组中的多个亚组。
那些仅作为细菌中一个或几个拷贝存在的质粒，在细胞分裂过程中面临着被丢失到一个分离细菌中的风险。那些单拷贝质粒实施了积极尝试将一个拷贝分配到两个子细胞的系统。
一些质粒包括成瘾系统，例如大肠杆菌中质粒 R1 的宿主杀伤（hok）系统。产生寿命较长的毒物和寿命较短的解毒剂。那些保留质粒拷贝的子细胞存活下来，而那些没有继承质粒的子细胞则会死亡或由于来自亲本细胞的挥之不去的毒物而生长速率下降。
质粒也自主复制。每个质粒都包含自己的 DNA 复制起始序列，但只有复制所需基因的一部分。一些质粒配备了自我保护基因，它们被称为成瘾模块。成瘾模块也迫使宿主细胞要么保留质粒，要么死亡。
Berg, Jeremy M. 等人。"生物化学"。第 6 版。W.H. Freeman and Company，纽约，2007 年。
质粒作为载体具有独特的特性，在基因工程中提供了一种通用的工具。质粒被用来通过将新基因引入受体细胞来创建转基因生物。例如，来自土壤细菌农杆菌的 Ti 质粒在植物病理学中非常有价值，用于培育对疾病（例如叶片上的黑穗病和冠瘿瘤）具有抗性的植物。
质粒由于其在抗生素合成中的作用，也具有医学意义。链霉菌属中的土壤细菌可以产生数千种抗生素，例如链霉菌属中的链霉菌属和链霉菌属。在另一个例子中，大肠杆菌质粒被用来克隆青霉素 G 酰化酶的基因，这种酶可以将青霉素 G 转化为抗菌的 6-氨基青霉烷酸。[1] 再次，这些克隆过程是在 II 型限制酶的帮助下进行的，以将目标基因插入到质粒载体中。
在 DNA 重组技术中，基于质粒的报告基因至关重要，因为它们允许实时观察生物体。绿色荧光蛋白的基因可以整合到正在研究的生物体的质粒中。编码的蛋白质很小，不会改变宿主蛋白质的功能。GFP 的这一特性使其非常容易观察细胞动力学。[2]
这些只是多年来开发的质粒的众多技术、应用和用途中的几个例子。随着更多例子和机遇的出现，质粒工程的未来看起来非常光明。
为了从细菌细胞中纯化质粒 DNA，需要进行碱性裂解质粒制备。将按照以下步骤制备三种溶液。
溶液 1：50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8、10mM EDTA、50 微克/毫升 RNase
添加葡萄糖的目的是增加细胞外的溶质浓度，因此，一旦细胞破裂，渗透压将使水从细胞中流出，并带走质粒。EDTA 是二价阳离子（如 Mg2+、Ca2+ 和 Mn2+）的螯合剂。这些阳离子会被结合并从溶液中去除。Mg2+ 是 DNase 的辅因子，因此如果它被结合起来，DNase 将无法消化 DNA，因此 DNA 将保持完整。RNase A 将降解任何存在的细菌 RNA。
溶液 2：0.2M NaOH、1%SDS
SDS 通过溶解细胞膜来裂解细胞。NaOH 产生的高 pH 值将使细菌蛋白质变性，因此它们会从溶液中沉淀出来。极端的 pH 值将使 DNA 变性，使双螺旋的两个链分离，从而产生细菌染色体和质粒 DNA 的单链。但是，小的互锁质粒链会保持在一起，因为它们紧密结合，因此 NaOH 无法进入。
溶液 3：3M 醋酸钾（29.4g KOAc + 11.5 毫升冰醋酸/ 100 毫升），pH 5.5
醋酸缓冲液将使溶液的 pH 值恢复到更接近中性的 pH 值。这将允许 DNA 链重新退火。染色体 DNA 太复杂太大，无法在这些条件下重新退火，因此只有质粒 DNA 重新退火。K+ 离子将与 SDS (-) 结合形成 KDS，KDS 会从溶液中沉淀出来。
Slonczewski, Joan L. 微生物学。"不断发展的科学"。第二版。