结构生物化学/DNA重组技术/限制性内切酶
限制性酶最初由 Werner Arber 和 Hamilton Smith 发现。Daniel Nathans 开创了它们的应用，这导致了重组 DNA 技术的出现。
限制性内切酶，也称为限制性酶，负责细菌中称为宿主控制限制修饰或表型修饰的现象。限制/修饰酶系统分为三类：I 型、II 型和 III 型。这些系统之间的主要区别在于 II 型酶包含独立的限制和甲基化系统，而 I 型和 III 型酶在一个酶中同时具有限制和甲基化特性，由两个或三个异源亚基组成。分子生物学中常用的商业限制性酶是由 II 型系统产生的。II 型限制性内切酶识别特定的回文序列（在两条链上读起来都一样，除了其中一条链是反向的）。限制性酶识别特定碱基对序列（大约 4-8 个碱基对长），并具有旋转对称轴。一旦建立了这个识别位点，它就会切断双螺旋 DNA 每条链上的磷酸二酯键。产生的片段数量和大小取决于待切割 DNA 中识别位点的出现频率。限制性内切酶将 DNA 切割成更小的片段，以便更容易地分析和操作。限制性内切酶可以帮助分析染色体结构、对长 DNA 分子进行测序、分离基因以及创建新的待克隆的 DNA 分子。
限制性酶的切割可以产生多种不同的末端。通常，这些末端具有 3'-羟基和 5'-磷酸基末端。一些切割产生单链突出端，称为粘性末端或粘性末端，而另一些则产生平末端。这些末端或切割位点随后可以退火并连接到载体 DNA 或任何具有兼容末端的 DNA。并非所有切割都一定是对称的，例如 BamHI，它以非对称的方式从 DNA 序列的两端切割。
也可以通过凝胶电泳观察限制性片段。可以使用三种不同的方法。第一种方法是聚丙烯酰胺凝胶，它可以分离高达 1000 个碱基对的片段。下一个是琼脂糖凝胶，它可以分离高达 20kb 的片段。最后，脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 可以分离高达数百万个核苷酸，这取决于电场打开和关闭时 DNA 的拉伸和松弛。然后可以使用放射自显影或溴化乙锭染色来观察 DNA。凝胶电泳通过电场运行，根据大小分离片段，注意较小的片段在凝胶中移动得更远，而较大的片段更靠近起点。与已知大小的标准相比，限制性酶切割的位置是已知的。
示例
假设以下 DNA 片段被限制性酶识别。红色 (*) 符号表示对称轴。这些切割位点的一个主要组成部分是在此轴周围存在二重旋转对称。切割位点也在图中突出显示。一旦建立了这个位点识别，限制性酶就会在双螺旋的对应链上切割突出显示的 C-G 和 G-C 之间的磷酸二酯键。请注意，不同的限制性酶具有不同的切割位点。因此，磷酸二酯键的切割并不总是发生在 C-G 或 G-C 之间。
- 5' C-C-G-C-G-G 3'
- *
- 3' G-G-C-G-C-C 5'
- 5' C-C-G-C-G-G 3'
BamHI 是限制性酶的一个例子。它切割回文序列，每次 6 个碱基。例如
此图像显示了 BamHI 在哪里切割回文序列。
BamHI 结合非特异性 DNA，并通过一个二聚体酶沿着 DNA 链滑动，该酶快速读取 DNA 以查找 6 个碱基的回文序列。如果它发现 6 个不是回文的碱基，它仍然会切割碱基，但切割效果不好。BamHI 在找到回文序列进行切割时工作效果最佳。
文件：催化机制.jpg 此图像显示了 BamHI 用于切割磷酸二酯键的机制。在第一步中，当与水反应时，底物获得一个羟基并使磷酸盐带上两个负电荷。金属通常处于过渡态，因为金属是正电荷，它平衡了两个负电荷，并使过渡态更稳定。镁是一种使用良好的金属。钙有时也被使用，但效果不佳，因为它会阻碍切割过程。然后将水添加到过渡态中，这导致质子捐赠给离去基团，最终断裂键并切割 DNA。
除了磷酸二酯键现在断裂，切割 DNA 外，反应前和反应后状态中的所有内容基本上保持相同，如下面的图片所示。
限制性内切酶由于两个主要特征而表现出其高度特异性。一个是被切割的限制性酶识别序列，不能降解宿主 DNA。第二，它们必须只切割被特异性识别的位点。限制性内切酶必须能够区分一个特定的切割序列和另一个序列。限制性内切酶能够通过甲基化过程表现出这些特性。存在于生物体中的甲基化酶保护包含被限制性酶识别的序列的生物体 DNA 免受切割。一旦甲基化酶将生物体自身碱基中的腺嘌呤甲基化，限制性酶就不会在这些位点切割。每种限制性内切酶都会导致宿主细胞中产生一种特定的甲基化酶，它会将宿主 DNA 中的特定序列位点甲基化。这种自我甲基化和限制性酶作用的系统被称为限制-修饰系统。宿主生物体产生的限制性内切酶只能切割没有被甲基化腺嘌呤标记的序列，从而实现限制性酶控制。
切割机制
如上所述，限制性内切酶切割氧 3' 和磷原子之间的键。限制性内切酶催化 DNA 中这些磷酸二酯键的水解。该反应的机制基于亲核进攻磷，产生五配位过渡态。这会导致双锥形结构。
I 型 I 型限制性酶是最先被发现的，它们是两种不同的大肠杆菌菌株的特征。识别位点是非对称的，由两部分组成：一部分包含 3-4 个核苷酸，另一部分包含 4-5 个核苷酸，这两部分由间隔区隔开。它们的活性需要几种酶辅助因子。I 型限制性酶具有三个亚基，称为 HsdR、HsdM 和 HsdS；HsdR 对于限制是必需的，HsdM 对于向宿主 DNA 添加甲基是必需的（甲基转移酶活性），HsdS 对于切割位点识别的特异性以及甲基转移酶活性很重要。
II 型 典型的 II 型限制性酶在几个方面不同于 I 型限制性酶。它们只由一个亚基组成，它们的识别位点通常是完整的且是回文序列，长度为 4-8 个核苷酸，它们在同一个位点识别和切割 DNA，并且它们在活性中不使用辅助因子（除了 Mg2+）。这些是最常获得和使用的限制性酶。
III 型 III 型限制性酶识别两个独立的反向排列的非回文序列。它们在识别位点之后大约 20-30 个碱基对处切割 DNA。
在对质粒DNA进行限制性酶切后，DNA片段在琼脂糖凝胶上进行分析。通过观察凝胶上得到的条带模式，可以确定DNA和载体的尺寸。这可以用来确认是否分离出正确的质粒。
从上面的图中可以得出以下结论：
第3和第6泳道用酶进行了两次消化。两条带代表两段线性DNA。较低的条带是基因插入多克隆位点中两个酶切位点之间的大小，另一个条带是质粒其余部分的大小。
第4和第7泳道用酶进行了一次消化。条带移动速度比其他线性DNA慢，表明DNA被切开。这个DNA解旋，但仍然是环状的，通常比相同大小的线性DNA移动得更慢。
第5和第8泳道未进行消化。超螺旋DNA比相同大小的线性DNA移动得更快。