结构生物化学/酶催化机制/蛋白酶/胰凝乳蛋白酶
胰凝乳蛋白酶，一种 蛋白酶，是一种通过一般酸碱催化，但主要通过共价催化的方式裂解某些肽键羰基侧的酶。在此机制中，亲核试剂在过渡态中与底物共价结合，形成酰基酶。蛋白酶通过水解反应（加入水分子）裂解蛋白质。碳和氮之间的双键加强了其键。胰凝乳蛋白酶具有位点特异性，只会裂解大型疏水或芳香族氨基酸（如苯丙氨酸 (Phe)、甲硫氨酸 (Met)、酪氨酸 (Tyr) 和色氨酸 (Trp)）的羧基侧，除非下一个氨基酸是脯氨酸 (Pro)。胰凝乳蛋白酶优先裂解大体积疏水氨基酸的原因是形成 S1 口袋，在胰凝乳蛋白酶的情况下，该口袋由相对疏水的残基排列，如 Ser-189、Ser-214、Trp-215、Gly-216 和 Gly-226。胰凝乳蛋白酶将反应速率催化了 109 倍。该反应分为两个步骤：酰化阶段和脱酰化阶段。在第一个阶段，肽键断裂，并在底物和酶之间形成酯。在第二阶段，这种酯被水解，酶再生。
这说明了胰凝乳蛋白酶的共价催化。第一步是酰化，形成酰基酶中间体。然后酰基酶中间体经过脱酰化反应，恢复到原始的游离酶形式。
由于胰凝乳蛋白酶还可以催化酯和酰胺的水解，因此将对硝基苯酚乙酸酯与胰凝乳蛋白酶结合使用。与对硝基苯酚乙酸酯的反应会生成对硝基苯酚，这是一种显色效应物，在产物中呈黄色变化。可以从颜色确定吸光度，强度可以确定产物的量。Hartley 和 Kilby 在 1954 年利用这些信息表明，反应分两个阶段进行：爆发阶段，然后进入稳态阶段。因此，形成了共价结合的酶-底物中间体。
另一个确定胰凝乳蛋白酶水解机制的测试是使用有机磷酸酯，二异丙基氟磷酸酯 (DIPF) 处理蛋白酶。在这种反应中，胰凝乳蛋白酶会失去所有活性并失活。由于只有丝氨酸-195 被二异丙基氟磷酸酯修饰，因此表明丝氨酸-195 在机制中起着亲核试剂的关键作用。它与丝氨酸-195 共价连接。胰凝乳蛋白酶的共价催化基本上经历了酰化和脱酰化。酰化形成酰基酶中间体，脱酰化添加水，生成游离酶。
定点诱变是另一种可以测试反应的技术，通过在酶活性位点的氨基酸序列中创造突变来进行。它通过证明通过定点诱变替换催化三联体中的任何一个成员对反应速率都有毁灭性的影响，从而支持了下面的机制。事实上，仅仅替换三联体中的一个成员就与替换所有三个成员具有相同的效果，这表明每个组分对有效催化至关重要。虽然酶继续与底物结合（我们知道这一点是因为 KM 在整个替换过程中保持不变，它需要相同的底物浓度才能达到最大速率的一半），但在没有三联体的情况下，反应速率小几个数量级。
一级结构表明，二硫键对蛋白质折叠至关重要。该蛋白质呈球状，本身由三条多肽链组成。蛋白质中还有一个称为活性位点的口袋。活性位点包括 Ser-195、His-57 和 Asp-102（催化三联体）。Ser-195 与 His-57 形成氢键，而 His-57 又与 Asp-102 残基形成氢键。His-57 的作用是定位丝氨酸残基并极化羟基，使其可以被去质子化形成烷氧负离子。在底物存在的情况下，它通过充当碱来接受质子。Asp-102 通过氢键和静电相互作用定向 His-57 并稳定它。
步骤 1：当底物（多肽）结合时，待裂解肽键旁边的残基侧链嵌套在酶上的疏水口袋中，将肽键定位以进行攻击。组氨酸从丝氨酸中提取一个质子，形成烷氧负离子。这种丝氨酸离子与底物反应。
步骤 2：在胰凝乳蛋白酶中，Asp102 的羧酸盐 R 基团与 His 57 的 R 基团形成氢键。当这种情况发生时，它会压缩这种氢键并将电子密度转移到 His 57 R 基团中的另一个氮原子（不参与 H 键），使其成为非常强的碱。这使得 His 57 可以使 Ser195 去质子化，并将其转化为可以攻击底物的强亲核试剂。
氧在氧阴离子孔中产生部分负电荷。
步骤 3：当底物羰基氧上的负电荷不稳定时，会导致四面体中间体坍塌，碳重新形成双键，从而断裂碳和氨基酸基团之间的肽键。离去基团被 His57 质子化，促进其位移。一旦氧阴离子孔稳定了负电荷，由于组氨酸的质子与氮结合，使碳的可能性降低，因此键断裂。离去基团被稳定，并形成酰基酶。
步骤 4：胺组分从酶中分离（被身体代谢）并与丝氨酸结合。这完成了第一阶段（酶的酰化）。第一个产物已经生成。
步骤 5：在 N 末端的位置添加一个水分子。组氨酸使水去质子化，形成羟基。这种羟基从羧基侧附着到碳上，并使酰基中间体不稳定。键断裂。
步骤 6：一个进入的水分子通过酸碱催化被去质子化，产生一个强亲核性的氢氧根离子。氢氧根对酰基酶的酯键的攻击生成第二个四面体中间体。
步骤 7：四面体中间体坍塌，形成第二个产物，羧酸根阴离子，并取代 Ser195。组氨酸的质子返回到丝氨酸。
步骤 8：羧酸被释放，酶恢复到其原始活性位点，以催化下一个反应。
