结构生物化学/膜蛋白/膜蛋白研究方法

研究膜蛋白非常困难。提取、纯化、均质化或从膜中去除它们可能意味着严重的信息丢失以及蛋白质解旋和展开。研究蛋白质膜的最佳方法是在细胞中模拟它们的天然环境，嵌入或附着在细胞膜上。

X射线晶体学

膜蛋白被证明通过X射线晶体学非常难以结晶，这主要归因于主要结构中存在的大量非极性氨基酸。传统上，在结晶膜蛋白样品时，科学家试图在样品制备过程中去除围绕膜蛋白的大量脂质。然而，现在科学家开始认识到脂质在结晶过程中是重要的添加剂。脂质添加或脂质立方相的使用导致越来越多的已解决膜蛋白。随着脂质的附着，科学家能够对蛋白质和脂质之间的不同相互作用进行分类和弄清楚。

脂肽类去垢剂

传统上，去垢剂已被用于提取用于研究的蛋白质-去垢剂复合物（PDC）的膜蛋白，例如X射线晶体学或核磁共振。所用特定去垢剂的有效性基于所需的蛋白质。各种去垢剂形成球形或椭球形胶束，这些胶束不能很好地模仿细胞膜以与蛋白质形成复合物。处于这种去垢剂溶解状态的膜蛋白容易出现不可逆聚集或其天然结构丢失等问题。在去垢剂中溶解也会导致结合的去垢剂分子与溶液中游离的分子不断快速交换。这使得核磁共振谱学非常困难，因为它通常需要在较长时间内保持高温。核磁共振一直局限于特别耐用的蛋白质。此外，由于与蛋白质结合的去垢剂分子数量，结构看起来是无序的，并且在电子密度图中不可见。

去垢剂的这个问题导致科学家认为膜蛋白相对于其他蛋白质来说很脆弱。然而，当在细胞膜中时，整合蛋白被多种因素稳定，包括蛋白质疏水部分的屏蔽以及脂质双层施加的侧向压力。这些因素在去垢剂溶解状态下不存在。此外，可能出现来自去垢剂的伪影。这会导致膜蛋白更容易失去其天然结构，这也导致蛋白质失活。所用去垢剂的有效性基于所用特定蛋白质和去垢剂。较差的去垢剂将无法很好地替代脂质双层，导致蛋白质降解。所有这些都会干扰蛋白质的研究。目前，十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM）是目前最有效的去垢剂，用于维持蛋白质稳定性。这是由于去垢剂形成的大胶束更能模仿脂质双层。

PDC是溶解的膜蛋白，与去垢剂形成复合物。该颗粒存在于溶液中，与游离的去垢剂单体和去垢剂胶束一起存在。结合的去垢剂分子与溶液中游离的分子之间存在持续交换。与目标蛋白结合的去垢剂数量可能占PDC质量的30-70%，相当于数百个结合到蛋白质上的去垢剂分子。这些分子也没有沿着蛋白质的疏水部分排列它们的疏水链。相反，它们以垂直于蛋白质的方式排列，并且在X射线晶体结构和电子密度图中看起来是无序的。

另一种去垢剂已被开发出来，能够更有效地复制膜双层，以稳定膜蛋白，使其能够更有效地研究，同时还能正常发挥作用。脂肽类去垢剂是两亲性分子，具有 25 个残基的肽，形成一个两亲性 α-螺旋，在 2 和 24 位具有 12 到 20 个碳的两个脂肪酸基团。这些链沿着疏水表面排列，形成一个楔形振动。它们能够形成小的圆柱形胶束，其内部更类似于脂质双层。这使膜蛋白能够更长时间地抵抗聚集和变性。此外，与传统去垢剂相比，脂肽类去垢剂相对较小，并保持刚性的外部表面。复合物的刚性有利于结晶和核磁共振。例如，X射线晶体学使用传统去垢剂提供了 10Å 的分辨率，而脂肽类去垢剂由于脂肽类去垢剂的高度有序性，能够提供 1.20Å 的分辨率。

然而，脂肽类去垢剂无法替代 PDC，因为它们成本更高。目前，膜蛋白的纯化仍使用 PDC 来提取蛋白质并使其溶解。一旦提取蛋白质，将脂肽类去垢剂添加到溶液中，并将混合物通过超滤浓缩器进行离心浓缩，使较小的脂肽类去垢剂能够通过，同时过滤掉较大的 PDC 复合物。向溶液中添加更多缓冲液并重复过滤过程数次，结果是去除 PDC 并将稳定的蛋白质溶解在脂肽类去垢剂中。这种方法需要最少使用脂肽类去垢剂，这降低了膜蛋白研究的成本。

虽然脂肽类去垢剂是研究蛋白质结构的相对较新且有效的工具，但它只是研究蛋白质的另一种方法。它不是蛋白质研究中各种问题的唯一解决方案。然而，它确实提供了一条新的途径来研究对早期方法构成挑战的更多整合蛋白。脂肽类去垢剂。

溶解环境对膜蛋白的重要性

细胞膜构成一系列不同的成分。异质环境影响膜蛋白的结构，因此影响其功能。这种异质环境使目前的方法难以确定膜蛋白的结构，因为膜环境的改变会导致结构发生改变。尽管膜蛋白因其在生物学中的作用而非常重要，但只有很少一部分的结构得到了确定。

对于较小的蛋白质和没有辅基的蛋白质，蛋白质-膜相互作用大于蛋白质内相互作用。辅基通过稳定蛋白质跨膜结构域来帮助克服蛋白质-膜相互作用。对于较大的蛋白质，蛋白质内相互作用足以克服这些相互作用。因此，在破译较小蛋白质的结构时，必须特别注意其环境。由于膜蛋白具有显著的构象灵活性，这对于其在天然条件下的功能可能是必要的。这方面的例子是离子通道在打开或关闭时发生的结构变化。这两种结构都有助于蛋白质的功能，并且需要膜通过克服蛋白质-膜相互作用来允许这种变化发生。也可能存在不影响蛋白质功能的构象变化，甚至可能抑制蛋白质的功能。这些变化可能是由相同的蛋白质-膜相互作用引起的。这在解开新蛋白质的结构时引起了特别的关注。

膜蛋白

这种关注是所分析的结构是否实际上是蛋白质的功能结构之一。在流感 A 病毒 M2 蛋白中可以看到这种情况。该蛋白质的结构已从液态液晶脂质双层样品、从去垢剂中结晶的样品以及去垢剂胶束中的样品中确定。每个样品代表不同的蛋白质结构，目前尚不清楚哪一种结构有助于蛋白质的功能。了解哪些结构与功能相关将有助于开发能够有效破坏病毒复制并防止流感大流行的药物，这些病毒会发生变异，不再对之前的药物治疗敏感。

在使用去垢剂溶解蛋白质时，务必注意脂类和去垢剂之间的差异会影响蛋白质结构。一个区别是单体脂类浓度比单体去垢剂的毫摩尔浓度低几个数量级。在一些蛋白质晶体结构中，这些单体去垢剂被观察到渗透到蛋白质结构域的水性孔中，这会损害其功能。其次，去垢剂胶束在其疏水部分是可以扩展的。这会导致设计为具有疏水失配的螺旋诱导螺旋倾斜，并导致它们紧密堆积。这也会影响蛋白质功能。最后，与膜表面相比，胶束表面的曲率更大。这种曲率的变化也会干扰两亲螺旋的表面结合。所有这些变化都涉及膜蛋白的环境。这些相互作用会对蛋白质结构产生重大影响，需要进一步研究才能揭示两者之间所有关系。