结构生物化学/神经退行性疾病
神经退行性疾病是与衰老密切相关的疾病，每年影响全球超过 1.2 亿人。一些神经退行性疾病通常通过其蛋白质的错误折叠和聚集来识别 - 这导致神经毒性。[1] 但，这一观点一直存在争议，并且根据最近的研究，人们对蛋白质的本质及其对神经退行性疾病的影响有了更好的了解。这一有争议主题的一个突出例子是阿尔茨海默病以及脑中 β-淀粉样蛋白 (Aβ) 的聚集。[2] β-淀粉样蛋白肽可以在大脑中以非毒性物质的形式存在，但是，在阿尔茨海默病患者的大脑中发现了这种肽的大量沉积物。这些退行性疾病与蛋白质聚集之间的联系已通过实验研究：基因突变、基因剂量增加和翻译后基因修饰。这些实验分别与帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病有关。尽管进行了这些实验，但这些关系仍然知之甚少。人们普遍认为，神经退行性疾病是由衰老、蛋白酶体和线粒体功能障碍、氧化应激以及异常的蛋白质-蛋白质相互作用（通过细胞毒性）引起的，一个更激进的建议认为，宏观蛋白质包涵体也是这些疾病发展中的一个重要因素。这些宏观包涵体已包含在许多疾病模型中，但最近才被观察到作为寡聚体和原纤维物种存在于活细胞中。
淀粉样蛋白假说 - 异常的蛋白质相互作用，这些相互作用积累并导致神经缺陷，最终导致神经退行性疾病，被认为与聚集的蛋白质插入有序的纤维状结构（如淀粉样蛋白膜）中具有因果关系。这是由于蛋白质畸形造成的 - 它们指定的伴侣蛋白不再识别它们，也不能被泛素-蛋白酶体系统破坏。结果，这些蛋白质能够保留在细胞中并对细胞产生有害影响。然后，这些细胞可以形成稳定的、不溶的淀粉样蛋白组装体，这些组装体主要由 β-折叠片组成。另一种组装体，寡聚物种，体积更小，据预测是淀粉样蛋白原纤维的前体或淀粉样蛋白生成级联反应中的异常中间体。
这是最常见的与年龄相关的疾病之一，通常与痴呆症相关。随着人口年龄的增长，阿尔茨海默病的发病率也在上升。在分子水平上，阿尔茨海默病最典型的特征之一是由 Aβ 和神经纤维缠结组成的细胞外淀粉样蛋白斑块。识别这些标志性特征还不够，因为尽管能够识别这些蛋白质，但它们的形成机制仍然未知。这部分是因为大多数阿尔茨海默病病例是随机发生的，没有明确的信号表明疾病何时开始。为了规避这一点，已开发出构象依赖性抗体，以帮助检查蛋白质聚集体并识别原纤维寡聚体和纤维。
光学显微镜和活细胞成像是通常用于研究神经退行性疾病发展类型的技术。
双分子荧光互补 (BiFC) - 该技术很有用，因为它可以在生理环境中使用（而不是从身体中提取）。此外，它有助于阐明蛋白质-蛋白质相互作用，并具有空间和时间分辨率。它还阐明了活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的功能。该方法涉及两个非荧光分子，它们是报告蛋白的片段，以及感兴趣的两种蛋白质。如果感兴趣的两种蛋白质相互作用，则报告蛋白的两个片段会结合在一起，形成一个模拟蛋白质天然形式的结构。近年来，这种技术很有帮助，因为它有助于解释寡聚化与神经退行性疾病之间的联系。还预计 BiFC 将能够帮助确定大脑中包涵体和寡聚物种是如何形成的。因此，BiFC 可以通过预测药物的合适靶点并建议治疗神经退行性疾病的新方法来帮助治疗研究。
该技术从 2002 年开始使用，除了神经退行性疾病外，还有许多其他应用。例如，它已被用于研究其生理状态下碱性亮氨酸拉链和 Rel 家族转录因子的相互作用。该方法也已用于几种模式生物，例如哺乳动物细胞系、植物、线虫、酵母和细菌。最初，它仅用于识别单个蛋白质-蛋白质相互作用。但在最近的实验中，它已被用于通过使用具有不同发射光谱的多种荧光蛋白来研究多种蛋白质-蛋白质相互作用。这一进步使得能够研究亚细胞定位、评估复合物的形成、分析对蛋白质-蛋白质相互作用的控制以及同时观察不同蛋白质复合物变化的能力。
BiFC 的另一种变体将报告蛋白与生物发光共振能量转移光谱结合使用，作为多色 BiFC 的替代方案。
BiFC 的优点
与许多较旧的技术相比，BiFC 具有两个主要优点。
1. 这种技术使用在蛋白质-蛋白质相互作用发生后引起荧光的分子，因为这种相互作用非常特异，因此不太可能有任何其他相互作用能够在报告蛋白中引起足够强的荧光。
2. 荧光复合物的使用允许在生物体内研究蛋白质-蛋白质相互作用，而不是从其自然环境中去除感兴趣的蛋白质，以对其进行染色和跟踪其作用。
BiFC 的缺点
1. 这种技术是识别蛋白质-蛋白质相互作用的间接方法，需要使用非常特殊的荧光报告蛋白。因此，如果其中一种蛋白质未知，则无法使用该方法来研究蛋白质之间的相互作用。这个问题已通过产生不同的 cDNA 附着在荧光蛋白片段上的文库来克服。
2. 使用该技术研究神经退行性疾病的局限性之一是，当蛋白质相互作用时荧光团重新结合时，则复合的荧光团将稳定相互作用的蛋白质，从而阻止观察到所需的相互作用。尽管存在此缺点，但这也有益，因为它允许更选择性地研究寡聚体和二聚体物种。对于神经退行性疾病研究，这种影响可能特别有用，因为通过稳定蛋白质复合物，复合物将能够在其相互作用状态下存在更长时间。这将使研究更多转瞬即逝的蛋白质-蛋白质相互作用变得更容易。这种技术现在使得研究蛋白质聚集过程成为可能，因为该过程的形成部分涉及这些短暂的蛋白质-蛋白质相互作用。3. 该方法不区分二聚体、寡聚体和更高阶物种。必须使用其他技术来完成此操作，例如流式细胞术或 SDS-PAGE。
冷冻电子显微镜 - 与核磁共振 (NMR) 光谱结合使用，这种技术有助于确定 β-淀粉样蛋白肽衍生组装体的结构。这很重要，因为对 Aβ 肽组装体的更深入了解将有助于解释 Aβ 聚集在大脑中的影响。
虽然目前的研究技术尚未完全了解蛋白质-蛋白质相互作用，但众所周知，它们对于理解生成的蛋白质及其在生理条件下的功能至关重要。异常蛋白质相互作用的一个常见结果是存在胞质、核或细胞外包涵体。这些包涵体通常是由于错误折叠的蛋白质积累成不溶的核或胞质淀粉样蛋白沉积物所致。蛋白质-蛋白质相互作用的变化被认为会导致这些包涵体的形成。虽然包涵体形成机制尚未完全了解，但研究表明，即使错误折叠的蛋白质不同，包涵体的形成也遵循一种普遍一致的模式。因此，需要确定有关包涵体的更多结论性数据，以便为治疗神经退行性疾病开发治疗技术。
蛋白质-蛋白质相互作用研究 过去，蛋白质-蛋白质相互作用通过共免疫沉淀和共纯化来研究。在这些过程中，蛋白质-蛋白质相互作用只能通过从其生理条件下移除蛋白质来观察。近年来，蛋白质微阵列也以类似的方式工作。将蛋白质从其环境中移除会引入误差来源，因为蛋白质-蛋白质相互作用也受其环境的影响，而将其从生理条件下移除意味着蛋白质不会像通常在细胞中那样发挥作用。相比之下，蛋白质片段互补测定（PCAs）、补偿性突变的功能分析和基于成像的技术能够通过避免将蛋白质从细胞中移除来更准确地识别蛋白质-蛋白质相互作用。
以前用于制作蛋白质-蛋白质相互作用图像的技术通常使用荧光或生物发光共振能量转移显微镜、荧光相关光谱和图像相关光谱。荧光共振能量转移显微镜很有用，因为它在体内用两种不同的荧光团标记两种相互作用的蛋白质。当供体荧光团被激发时，它将能量转移到第二种荧光团，即受体荧光团，它将标记第二种蛋白质。两种蛋白质之间的距离由两种荧光团寿命之间的差异决定。然而，这种技术受到限制，因为两种蛋白质之间的距离必须小于 10 纳米，否则两种荧光团的发射光谱将不会重叠。这种技术已被用于研究淀粉样前体蛋白基因的突变及其与 presenilin-1 的相互作用的影响。这种技术也可以用来表征分子内和分子间相互作用。
荧光相关光谱 是一种生物成像技术，它使用理论分析来解释荧光标记分子的波动和扩散速率。特定的波动与相互作用蛋白质的特定相互作用和聚集模式相关。这种方法已被用来研究肽 β-淀粉样蛋白聚集体的形成方式。