结构生物化学/核酸/DNA/基因敲除小鼠

一般信息

基因敲除小鼠是研究人员用于实验室实验的小鼠，旨在了解特定基因失活或“敲除”的后果。一般来说，在生物体中为了实验目的进行基因过表达或表达不足被称为转基因技术 。此过程通过破坏或用人工 DNA 片段（目标基因的突变版本）替换现有基因来完成 。由于破坏，基因活性会丧失，从而导致小鼠表型的变化。当小鼠表型受到影响时，外观、行为和其他身体特征的变化应该在后代中显而易见。

目的和应用

由于小鼠和人类的许多基因相似，从小鼠中提取或“敲除”特定基因可以提供证据，以进一步了解基因在人类中的功能程度 。这通常表现为动物的物理特征、行为特征或调节小鼠功能的生化途径的变化 。这种实验室技术已应用于各种类型的研究

• 癌症研究
• 囊性纤维化
• 肺、心脏、血液和帕金森病
• 衰老
• 焦虑
• 关节炎
• 糖尿病
• 肥胖
• 神经通路功能
• 药物滥用

从基因敲除小鼠中研究的特定基因也可用于研究不同的娱乐性药物如何影响动物，这可用于测试针对人类药物滥用的疗法 。例如，p53 基因敲除小鼠侧重于一种机制 - p53 - 它编码抑制肿瘤生长并阻止细胞分裂的蛋白质。通过去除该基因，小鼠有患各种类型癌症（血液、肺、脑、骨骼等）的风险。这很有用，因为人类的这种基因异常会导致 **李-弗劳梅尼综合征**，这是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，会导致人们患癌风险大大增加。

局限性和弱点

虽然基因敲除小鼠技术是一种极好的研究工具，但在敲除特定基因时，经常会出现并发症。例如，小鼠可能依赖于感兴趣的基因来执行其他重要的身体功能；如果该基因被破坏，小鼠可能会死亡或以意想不到的方式停止正常运作。此外，在小鼠中被敲除的基因甚至可能不会在小鼠的任何特征中产生可观察到的变化。这使得很难将研究与人类研究联系起来。小鼠胚胎中的基因敲除有时会抑制小鼠长成成年小鼠。这使得研究局限于小鼠的产前阶段，进一步扩大了小鼠中的基因敲除与人类之间的联系。

制备基因敲除小鼠的方法

基因敲除小鼠繁育方案

基因敲除小鼠是由胚胎干细胞（ES 细胞）产生的，这些细胞是在受精后大约 4 天收获的。使用 ES 细胞的原因是因为在如此早的阶段，基因序列的交换可以在细胞分裂期间正确地传递给其余细胞，并随着所有其他成体细胞一起发育。此过程通过以下两种方法之一完成

基因靶向

在基因靶向中，通过同源重组 在小鼠 ES 细胞的细胞核内操纵特定基因。要开始同源重组，需要知道需要替换的基因的 DNA 序列。下一步是制作一个需要插入染色体的新的 DNA 序列。该染色体将取代野生型等位基因。人工非活性 DNA 序列被引入（这部分序列与被敲除的基因几乎完全相同）。此人工序列在染色体上以两个方向包围 DNA 序列。细胞识别相同的 DNA 片段，并将现有基因与人工 DNA 进行“交换”。由于人工 DNA 是非活性的，因此现有基因的功能现在已被基因靶向“敲除”。新细胞将继续生长和分裂，其中包含新的基因。

**示例：**分离来自灰毛物种的囊胚阶段小鼠的胚胎。然后，从囊胚中取出胚胎干细胞，并在组织培养中进行培养。转移同源重组基因，并在甘昔洛韦和新霉素中培养。然后将具有新的白色毛发基因的细胞转移回囊胚。许多转化的囊胚将被植入具有白色毛发的假孕小鼠中。小鼠将产下一部分白色小鼠，一部分带有灰色斑点的小鼠，表明旧基因的活性。带有斑点的小鼠 - 意味着它们既有灰色毛发基因，也有白色毛发基因 - 将与白色小鼠交配。如果灰色白色小鼠的配子来自重组干细胞，那么它将产下全部灰色小鼠。小鼠体内的所有细胞都对毛发基因杂合。然后，灰色小鼠将与杂合小鼠一起交配。确定哪只小鼠具有纯合重组基因，并交配它们，直到两个等位基因都被敲除。最终结果是基因敲除小鼠，此时两个等位基因都被敲除。

基因陷俘

基因陷俘是通过使用人工 DNA 序列来完成的，该序列包含一个“报告基因”，该基因被设计成随机插入任何基因中。人工 DNA 阻止细胞中的 RNA 剪接，从而阻止现有基因合成其指定蛋白，并消除其功能。现在可以观察和研究人工“报告基因”的活性，以确定现有基因在小鼠中的正常功能。

哪种方法更好？

这两种方法都使用 DNA 载体将人工 DNA 导入小鼠胚胎干细胞。 DNA 注入后，细胞在体外培养，然后注入小鼠胚胎。 这些胚胎被植入雌性小鼠体内，雌性小鼠随后产下基因敲除的小鼠。

两种方法都有各自的优势。 例如，在基因靶向中，靶基因在 DNA 序列中是已知的。 这种方法允许研究人员敲除他们发现有趣的序列。 另一方面，虽然基因捕获中敲除的特定基因未知，但它会创造不同类型的小鼠，因为“报告基因”的结合没有效率或精度； 由于随机性，找到特定基因的功能可能变得很麻烦。 研究人员需要花费大量时间测试 ES 细胞以确定哪个基因已被敲除。 此外，可能以随机方式敲除一个不容易选择的特定基因。

资源

1. 维基百科：基因敲除小鼠 [1]
2. 国家人类基因组研究所：基因敲除小鼠 [2]