结构生物化学/核酸/DNA
什么是 DNA？ DNA 是一种长链线性聚合物，包含脱氧核糖和共价键合的碱基，被称为核酸。DNA 的主要功能之一是存储遗传信息。在 DNA 中，三个碱基的序列被称为密码子，负责编码单个氨基酸。氨基酸在翻译过程中被添加到正在生长的蛋白质中。这些核酸聚合物以基因的形式编码生物体生存所需的所有物质。基因是 DNA 的小片段，它告诉细胞应该创建哪些蛋白质。给定细胞接收的基因类型完全取决于亲代细胞。基因在代代相传，以确保生物体在遗传上的生存。
DNA 代表脱氧核糖核酸。前缀“脱氧”将 DNA 与其近亲 RNA（核糖核酸）区分开来。该前缀表明，与核糖不同，脱氧核糖在 2' 碳处不含羟基，而是用单个氢原子替换了它。这种羟基的缺失对于确定 DNA 能够在细胞核中自我浓缩的方式至关重要。
DNA 是一种核酸，能够通过称为 DNA 聚合酶的酶自我复制。DNA 上的四个碱基，腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鸟嘌呤 (G) 和胸腺嘧啶 (T) 中的每一个都共价键合到脱氧核糖上。DNA 中的四个核苷酸单元称为脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸和胸苷酸。核苷酸包括核苷，即与脱氧核糖或核糖基团键合的含氮碱基。DNA 中的四个核苷是脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸腺嘧啶。通过将一个或多个磷酸基团通过酯键连接到核苷，形成核苷酸。
脱氧核糖通过一个 磷酸二酯键 形成 DNA 的结构主链，该键位于一个核苷酸的 3' 碳和下一个核苷酸的 5' 碳之间。当 DNA 不自我复制时，它以双链螺旋分子的形式存在于细胞中，链彼此反平行排列。也就是说，如果一条链的方向是 3' 到 5'，则另一条链的方向将是 5' 到 3'。每条链的碱基非常特异性地结合在一起，A 与 T 结合，C 与 G 结合，至少在 DNA 中不存在其他组合。碱基通过氢键相互内部结合，磷酸二酯键 主链朝外。正是这里，缺少的 2' 羟基在 DNA 中起着重要作用。正是由于该基团的缺失，DNA 才能形成其传统的双螺旋结构。RNA 在 2' 碳处确实具有一个羟基，无法获得相同的螺旋结构。沃森和克里克首次提出了现代的双螺旋 DNA 结构，并且 DNA 的功能在一系列实验中得到证实，这些实验将在接下来的几节中讨论。
为什么是 DNA？ 值得注意的是，DNA 是所有细胞传递遗传信息的主要方法的原因。也就是说，为什么进化偏爱 DNA 世界而不是 RNA 世界，因为这两种分子在结构上如此相似？这些原因包括化学稳定性、形成和断裂化学键所需的能量以及执行此任务的酶的可用性。主要原因涉及两种分子的相对稳定性。DNA 比 RNA 更具化学稳定性，因为它在 2' 碳上缺少羟基。在 RNA 中，分子可以形成 磷酸二酯键 的两个可能的 OH 基团，这意味着 RNA 不像其脱氧对应物那样被强制进入相同的刚性结构。此外，DNA 中的 脱氧核糖 比 核糖 在 RNA 中的反应性要低得多。简而言之，C-H 基团比 C-OH（羟基）基团的反应性要低得多。这种差异也解释了为什么 RNA 在碱性条件下不稳定，而 DNA 则稳定。碱性条件下的碱基与 C2 位置的 -OH 基团的作用相同。此外，双链 DNA 具有相对较小的沟槽，破坏性酶无法附着，使其更难“攻击” DNA。另一方面，双链 RNA 具有更大的沟槽，因此更容易被酶分解。双链 DNA 之间的连接比双链 RNA 之间的连接更紧密。换句话说，解开双链 RNA 比解开双链 DNA 要容易得多。总的来说，RNA 的分解和重组比 DNA 的分解和重组速度更快，所需的能量更少。对于生物体的生存和健康而言，将遗传物质编码成更稳定、更抗变化的东西至关重要。此外，DNA 的序列及其物理构象似乎在 DNA 的选择中也起着作用。另一个有助于阐明 DNA 作为遗传信息主要存储方式的普遍性的观点是分解 DNA 的酶的可用性。人体主动破坏外源核酸酶，核酸酶是切割 DNA 的酶。这只是 DNA 免受损伤的众多方式之一。人体实际上可以识别外源 DNA 并将其破坏，同时保持自身 DNA 完整无损。
高色效应 DNA 另一个独特的特征是其双链形式的 高色效应，它描述了与分子非螺旋构象相比，双螺旋链对紫外电磁辐射的吸收降低。由于螺旋构象中糖堆积，互补 DNA 链之间的氢键导致芳香环变得更加稳定，因此吸收的紫外辐射更少。这最终使紫外吸收量降低了 40%。随着温度的升高，这些氢键溶解，螺旋结构开始解开。在这种解开的形式中，芳香环可以自由地吸收更多的紫外辐射。
1. 由 2 条链组成（反平行且互补）：DNA 具有两条多核苷酸链，它们以相反的方向围绕螺旋轴扭曲。
2. 它由脱氧核糖、外部的磷酸骨架和内部的核酸碱基组成。
3. 碱基垂直于螺旋轴，相隔 3.4 埃。
4. 链通过氢键和其他各种分子间力结合在一起，形成双螺旋。碱基配对涉及 A - T 的 2 个氢键和 C - G 的 3 个氢键 - 请参见右侧的图像
5. 骨架由交替的糖和磷酸盐组成，其中磷酸二酯键构成 DNA 的共价骨架。DNA 的方向是从 5' 磷酸基团到 3' 羟基。
6. 每 10 个碱基重复一次
7. 由于疏水效应和范德华力，弱力稳定 DNA。
8. DNA 链宽 20 埃（2 纳米）
9. 一个核苷酸单元长 3.3 埃（0.33 纳米）
DNA 由两条多核苷酸链（链）组成，它们围绕公共轴以相反的方向运行。因此，DNA 具有双螺旋结构。DNA 的每条多核苷酸链都由单体单元组成。一个单体单元由三个主要成分组成，即糖、磷酸盐和含氮碱基。DNA 单体单元中使用的糖是脱氧核糖（它在呋喃糖环的第二个碳上缺少一个氧原子）。DNA 单体单元中还可以使用四种可能的含氮碱基。这些碱基是腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胞嘧啶 (C) 和胸腺嘧啶 (T)。腺嘌呤 和鸟嘌呤 是嘌呤 衍生物，而胞嘧啶 和胸腺嘧啶 是嘧啶 衍生物。聚合物链是通过磷酸二酯键连接核苷（与含氮碱基共价连接的糖）而形成的。聚合物链是 DNA 分子的单链。两条链以相反的方向运行以形成双螺旋。使这些链保持在一起的力是氢键、疏水相互作用、范德华力和电荷-电荷相互作用。氢键在反平行链的碱基对之间形成。第一条链中的碱基仅与第二条链中的特定碱基形成氢键。这两个碱基形成一个碱基对（使链保持在一起并形成双螺旋结构的氢键相互作用）。碱基对是：腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A-T)、胞嘧啶-鸟嘌呤 (C-G)。这种相互作用给了我们提示，含氮碱基位于 DNA 双螺旋结构的内部，而糖和磷酸盐位于双螺旋结构的外部。疏水碱基位于 DNA 的双螺旋内部。位于双螺旋内部的碱基一个叠一个地堆积起来。堆积的碱基通过范德华力相互作用。即使范德华力很弱，这些力的总和也可能是相当大的。两个相邻碱基之间的距离（垂直于主轴）为 3.4 A˚。DNA 结构 是重复的。每圈有十个碱基，因此每个碱基的旋转角度为 36°。双螺旋的直径约为 20 A˚。疏水效应使双螺旋稳定。DNA 的结构变化是由于不同的脱氧核糖构象、磷酸脱氧核糖骨架中连续键的旋转以及围绕 C-1'- N（糖苷键）的自由旋转造成的。
Southern 印迹技术通常用于发现样品的 DNA 序列。该技术以埃德温·萨瑟恩命名。
在探索基因和基因组时，这取决于所使用的技术工具。五种重要的 DNA 操作技术是
1. 限制性核酸内切酶 - 也称为限制性酶
限制性酶将 DNA 分裂成特定的片段。通过将 DNA 分裂成不同的片段，可以操纵 DNA 片段。
2. 印迹技术
为了分离和表征 DNA，使用 Southern 印迹技术。该技术类似于 Western 印迹，不同的是 Southern 印迹用于 DNA 而不是 RNA。该技术通过琼脂糖凝胶电泳鉴定特定的 DNA 序列。将大片段放在顶部，小片段放在底部，分离 DNA。接下来，将 DNA 转移到硝酸纤维素膜上。然后，添加与该序列互补的 32-p 标记的 DNA 探针以杂交片段。最后，使用放射自显影膜来查看包含该序列的片段。
3. DNA 测序
通过使用 DNA 测序技术，可以确定 DNA 分子的精确核苷酸序列。DNA 测序的关键是生成长度取决于序列最后一个碱基的 DNA 片段。尽管存在不同的替代方法，但它们都在四个反应混合物上执行相同的程序。
A. 链终止 DNA 测序
总是需要引物。为了产生片段，在四种混合物中的每一种中都添加了 dNTP 的 2', 3'- 二脱氧类似物。它将停止该 N- 二脱氧的序列。可以使用 dNTP 的类型是 dATP、TTP、dCTP、dGTP。最后，新的 DNA 链被分离以进行电泳。
B. 碱基的荧光检测
在四种链终止二脱氧核苷酸的每一种中，以不同的波长使用荧光标记。它是一种有效的方法，因为它不使用放射性试剂，并且可以确定大量碱基序列。通过使混合物通过高压分离片段。然后，通过其荧光检测片段，碱基序列基于颜色序列。
C. 自上而下（鸟枪法）基因组测序方法
自上而下方法和鸟枪法类似，主要区别在于自上而下方法需要详细的克隆图。鸟枪法随机对大型克隆进行测序，以便在计算上进行匹配。
D. 微阵列（绿色芯片）)
在研究大量基因的表达时，使用微阵列很有用。微阵列是通过使用寡核苷酸或 cDNA 创建的。根据荧光强度，将出现红色或绿色标记。如果为红色，则表示没有荧光，称为基因诱导。如果为绿色，则表示荧光表达，称为基因抑制。
4. DNA 合成
为了合成 DNA，使用固相方法。固相合成是通过亚磷酸三酯法进行的。在这个过程中，每一组只添加一个核苷酸。第一步是结合第一个核苷酸。添加另一个核苷酸并被激活并与包含 DMT 的 3' - 磷酰胺酯反应。连接具有 DMT 和 βCE 的脱氧核苷 3' - 磷酰胺酯，因为它具有合成任何 DNA 的能力。它也是一种经过修饰和保护的碱基核苷酸。然后，该分子被氧化以氧化磷酸基团。最后，通过添加二氯乙酸去除 DMT。总的来说，所需产物仍然不溶，并在最后释放。
5. 聚合酶链式反应 (PCR)
PCR 是一种用于扩增两个核苷酸之间 DNA 序列的技术。如果已知 DNA 序列，则可以使用该技术获得该序列的数百万个拷贝。为了进行 PCR，需要 DNA 模板、前体和两个互补引物。使 PCR 独特的是，温度在三个不同阶段不断变化，并且这些阶段重复 25 次。三个阶段是
1. 变性 - 通过将溶液在 94°C 下加热，DNA 从双链（亲本 DNA 分子）变性为两条单链。
2. 退火 - 让溶液冷却后，在靶链的 3' 端和互补链的 3' 端添加两个合成寡核苷酸引物。当温度在 50°C - 60°C 之间时，完成此过程。
3. 聚合 - 在 72°C 下添加耐热 DNA 聚合酶以催化 5' 到 3' DNA 合成。
结构变异是由于不同的脱氧核糖构象、围绕 C-1 的自由旋转以及磷酸脱氧核糖骨架中最近键的旋转造成的。
DNA 有 A、B 和 Z 三种形式的二级结构。A 形：1. 右手螺旋 2. 糖苷键构象为反式 3. 每螺旋圈需要 11 个碱基对 4. 直径大小约为 26 埃 5. 糖皱褶构象位于 C-3' 内侧。
B 形：1. 与 A 形类似，B 形为右手螺旋。2. 糖苷键形成是反式 3. 每螺旋圈需要 10.5 个碱基对 4. 直径大小约为 20 埃 5. 糖皱褶构象位于 C-2' 内侧
Z 形：1. 与 A 形和 B 形不同，Z 形最明显的区别是它是左手螺旋。2. 糖苷键形成由两个成分组成：嘧啶和嘌呤。反式（对于嘧啶）和顺式（对于嘌呤） 3. 每螺旋圈需要 12 个碱基对 4. 直径大小约为 18 埃 5. 糖皱褶构象位于 C-2' 内侧（对于嘧啶）和 C-3' 内侧（对于嘌呤）
DNA 文库是克隆的 DNA 片段在克隆载体中的集合，可以在其中搜索感兴趣的 DNA。如果目标是分离特定的基因序列，则两种类型的文库很有用。
基因组DNA文库是由生物体的基因组DNA制成的。例如，小鼠基因组文库可以通过使用限制性核酸内切酶消化小鼠核DNA来制成，从而产生大量不同的DNA片段，但所有片段都具有相同的粘性末端。然后将这些DNA片段连接到线性化的质粒载体分子或合适的病毒载体中。这个文库将包含小鼠的所有核DNA序列，可以用来寻找任何感兴趣的特定小鼠基因。文库中的每个克隆被称为基因组DNA克隆。并非每个基因组DNA克隆都包含完整的基因，因为在很多情况下，限制性酶会在基因内部至少切断一次。因此，一些克隆只包含基因的一部分。
cDNA文库是mRNA的文库。它由内含子和外显子构成，cDNA文库的制作是为了能够分离基因/基因的最终版本。
cDNA文库用于筛选菌落。如果要寻找一个基因，可以筛选菌落，使用质粒集合，转化细菌，并使用探针。还可以使用Southern杂交。通过使用与正在寻找的基因互补的寡核苷酸，最终可以确定哪些细菌菌落具有与质粒中mRNA相对应的DNA。
如何制作cDNA文库
1. 从细胞中分离mRNA。
2. 使用逆转录酶和dNTPss，从原始mRNA创建DNA拷贝。
3. RNA比DNA更容易降解，因此放入碱性溶液中降解mRNA。
4. 使用DNA聚合酶完成模板。
最终，得到的是双链DNA，其中一条与mRNA相同。在对所有mRNA完成此操作后，可以将其克隆到质粒中。质粒集合将包含所有mRNA，但以DNA的形式。[1]
- 遗传信息存储：基因组
- 复制：DNA --> DNA
- 转录：DNA --> RNA
- 翻译：RNA --> 蛋白质
- ↑ Viadiu, Hector. "制作cDNA文库。"UCSD。讲座。2012年11月。
http://clem.mscd.edu/~churchcy/BIO3600/bio3600_images/phosphodiester_bonds.htm http://www.science-projects.com/hyperChromic1.htm
Berg，Jeremy。生物化学。第7版。纽约：W.H Freeman and Company，2012。印刷版。
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Berg，Jeremy，Tymoczko J.，Stryer，L.（2012）。蛋白质组成和结构。生物化学（第7版）。W.H. Freeman and Company。ISBN1-4292-2936-5
Hames，David。Hooper，Nigel。生物化学。第三版。纽约。泰勒和弗朗西斯集团。2005年。