结构生物化学/核酸/DNA/复制过程
DNA 复制是所有细胞分裂所必需的，这使得生物体能够生长。在 DNA 复制中，DNA 首先被分成基因组中的两条子链，这些子链携带与原始细胞完全相同的遗传信息。该链分离的起点称为“起点”。DNA 的双链结构有助于复制机制；这两条链首先被分离成两条单独的链。然后，这两条分离链的互补链由 DNA 聚合酶（一种专门用于制造互补链的酶）重新创建；它将找到每条链的正确互补碱基，并将从 5' 到 3' 延伸。原始链被保存的过程称为“半保留复制”。DNA 复制在生物体的生命周期中是必不可少的。它是在位于复制起点处的双链 DNA 分离或熔化时启动的。当双链 DNA 熔化时，熔化区域会传播，并形成成熟的复制叉。DNA 熔化以及复制叉的形成由起始因子、解旋酶和其他细胞因子协调。最近在起始因子和复制解旋酶的结构生物化学研究方面的进展在古细菌和真核细胞中得到了强调。这些研究的结果为 DNA 复制早期阶段的可能机制提供了新的见解。
基因组 DNA 是所有生物体中普遍存在的、必要的和必不可少的过程。复制可以分为起始、延伸和终止三个步骤。
在起始过程中，起始因子识别并结合复制起点 DNA，将其转化为复制叉。起始的步骤由以下步骤组成：起始因子在 DNA 起点周围组装，并且 dsDNA 起点被熔化。dsDNA 的熔化在起点的两侧产生复制叉，以允许双向复制。然而，在这一步发生之前，必须克服拓扑限制才能将熔化的起点转化为叉结构。为了诱导起始因子在起点的组装，可以利用生化方法来检测起点 dsDNA 的初始熔化。在古细菌和真核细胞系统中，起点熔化的持续时间尚不确定。然而，已证明起点熔化是由 LTag 的组装诱导的。SV40 LTag 能够诱导起点熔化和解旋，因此被认为是真核系统中的起始因子[检查拼写]。它已被用作研究起点识别、组装和熔化过程的模型。为了从熔化的 dsDNA 起点转化，在活性复制叉处组装的起始因子会扩展熔化区域并将解旋酶定位到叉上。
起始步骤是 DNA 复制中三个步骤之一（连同延伸和终止）。在起始中，许多称为起始因子的复制蛋白将 DNA 转化为复制叉。首先是起始蛋白在 DNA 周围组装，导致 dsDNA（双链 DNA）起点的熔化。然后，起点熔化开始在熔化起点的两侧产生复制叉。这产生了双向复制。环形解旋酶协助这个过程。然而，由于缺乏高分辨率结构，起始因子和解旋酶如何熔化和解旋起点 DNA 的机制尚不清楚。
在真核和古细菌细胞系统中，起始蛋白包括 Orc、Cdc6、Cdt1 和 MCM（微型染色体维持）解旋酶。MCM 是解旋叉形成中最重要的因素之一。MCM 形成六聚体，可以二聚化为双六聚体。SV40 大 T 抗原（LTag）的解旋酶能够识别起点 DNA，并且可以在不使用辅因子的情况下将 DNA 熔化并解旋为复制叉。SV40 LTag 被认为是真核系统中的典型起始因子/解旋酶，是研究识别、组装和熔化的模型。
LTag 六聚体的晶体结构揭示了一个（13-17Å）的通道，足以让 ssDNA 通过，但不能让 dsDNA（20 Å）通过。据信，即使在起点处组装期间，熔化的 ssDNA 也被包围在六聚体解旋酶的中心通道中。
LTag 还显示了中心通道中的 β-发夹，它以平面排列的方式配置。β-发夹与 DR/F 环形成 2 个相邻的平面环，这有助于 AAA+ 结构域中通道的最窄部分。人们质疑 LTag 是否可以扩展以容纳 dsDNA，或者 dsDNA 是否由起始因子/解旋酶修饰以适应狭窄的通道。然而，对于后者来说，LTag 必须挤压和压碎 dsDNA，这会破坏碱基对并熔化 dsDNA。这种模型通常被称为“挤压打开模型”。
最广泛接受的叉解旋模型是环形解旋酶围绕 DNA 链迁移，并将其分离为 ssDNA。
在原核细胞中，细菌复制酶包含聚合酶、聚合酶 III（Pol III）、β2 因子和 DnaX 复合物。它们在许多方面都是非常高效的，并且在冈崎片段合成期间循环速度更快。DnaA（一种起点识别蛋白）可以启动起点熔化为单链 DNA（ssDNA）。ssDNA 是加载六聚体解旋酶 DnaB（仅以单六聚体形式存在）的位点。细菌拥有的一个解旋酶是 DnaB6，它可以在复制叉处分离两条链。它在 5'-->3' 方向上转运。DNA 聚合酶 III 全酶（Pol III HE）在复制叉处接触，并且也充当二聚体，在冈崎片段合成期间似乎对滞后链具有受调节的亲和力，以便在引物之间循环。DnaB 利用 ATP 水解沿着链向下移动，以分离两条链。引物酶与解旋酶相互作用，并与冈崎片段合成的短 RNA 引物结合。RNA 引物通过 Pol III HE 不断延伸，直到接收到信号以更换复制叉处的下一个引物。在这个过程中，冈崎片段之间的间隙被填补，RNA 引物被 DNA 聚合酶 I 删除，并被 DNA 连接酶封闭。DnaB 的 N 端是自由的，用于停靠引物酶，这使得引物酶在叉解旋期间很容易捕获从 N 端结构域出现的 ssDNA。
尽管人们对双链 DNA 熔化启动的复制知之甚少，但最近的研究揭示了该过程可能机制的一些信息。从古细菌中发现了两种包含起始因子和起点 DNA 的共晶体结构，它们表明起始因子是如何识别双链起点 DNA 的。这些复合物，Cdc6/Orc-dsDNA 显示双链 DNA 发生变形和弯曲，但没有熔化。因此，研究人员认为，为了触发双链 DNA 的熔化并生成复制起点处的更高阶复合物，需要像上面提到的 MCM 这样的起始因子。
此图展示了 DNA 复制起始复合物结构的示例，具体展示了 Cdc21 和 Cdc54（类似于上面描述的 Cdc6）的 N 端结构域。起始复合物，Cdc6/ORC 1（未在此图中展示，但可以由上图表示）结合到复制起点并弯曲 DNA。引用：http://www.ebi.ac.uk/ http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c6/PDB_1ltl_EBI.jpg 在真核生物中，SV40 Ltag 在复制起点能够触发复制起点的解链和随后 DNA 的解旋，使其成为作为模型系统用于研究复制起点识别、组装和双链 DNA 解链的起始解旋酶。已显示未与 DNA 结合的 Ltag 六聚体的晶体结构具有通道，这些通道似乎只能结合单链 DNA，而不能结合双链 DNA，因为这些通道通常约为 13 至 17 Å（埃），而双链 DNA 分子的直径约为 20 Å，导致双链 DNA 分子无法进入通道。通常，DNA 易位研究表明，为了使双链 DNA 进入 Ltag 六聚体通道而不改变其形状，通道的直径必须至少为 20 Å。除了不够大之外，Ltag 六聚体的晶体结构在中间通道中具有 β 发夹的平面排列。
这里是一个 β 发夹的示例，它是 LTag 六聚体结构的一个组成部分。β 发夹中的 β 链是反平行的，这意味着一个 β 片的 N 端与另一个 β 片的 C 端对齐。在 LTag 六聚体的情况下，β 发夹位于通道中心区域的同一平面上。引用：http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Beta_hairpin.png
最近，冷冻电镜证明了 Ltag 六聚体通道可以通过两个六聚体包围双链 DNA 分子而结合双链 DNA 分子。然而，研究人员仍然不确定双链 DNA 是否因起始解旋酶而改变构型，或者 Ltag 是否变宽以允许双链 DNA 结合。一种模型，即挤压开放模型，断言 Ltag 六聚体可以通过将 DNA 挤过通道来将复制起点双链 DNA 塞入其更窄的通道中。结果，碱基对被破坏，双链 DNA 复制起点解链发生。该模型已被提出，并且正在确认中，因为它似乎与有关 DNA 解链的已知数据一致。
挤压泵模型形成的复制叉
挤压泵模型源于 Ltag 六聚体结构的信息。该结构包括如上所述的窄通道、AAA+ 运动结构域、单链 DNA 可以离开的侧通道和 Zn 域间。该模型基于上面描述的挤压开放模型使 DNA 解链，其中解链的 DNA 被泵送到 Zn 域，直到它产生单链 DNA 环，然后可以离开通道并形成复制叉。
单链和部分水解双链 DNA 的易位：研究人员证明了双六聚体 LTag 和 MCM 具有解旋 DNA 的能力。已显示 Ltag 能够在双六聚体形式中解旋包含内部复制起点序列的长双链 DNA。这与叉解旋的立体排斥模型不同，后者是目前最广泛接受的模型。该模型基于证据表明，环形解旋酶围绕一条 DNA 链并沿其移动到双链 DNA 叉，同时在此过程中暴露单链 DNA 链。
上图展示了一个环形六聚体解旋酶结构，它围绕 DNA 链并沿其移动（图中未显示）。引用：http://www.ebi.ac.uk/Information/termsofuse.html ; http://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1g8y_EBI.jpg
资料来源
Curr Opin Struct Biol. 2010 年 9 月 24 日。[提前出版] DNA 复制中的复制起点 DNA 解链和解旋。Gai D, Chang YP, Chen XS。南加州大学分子和计算生物学，美国加州洛杉矶市 Childs Way 1050 号，90089。
几十年来，人们对 DNA 复制和蛋白质合成进行了单独的研究。很少有科学家讨论这两个对生物体至关重要的过程之间的联系。Jonathan Berthon、Ryosuke Fujikane 和 Patrick Forterre 在他们的文章“当 DNA 复制和蛋白质合成走到一起”中共同提供了对这些看似独立的结构生物化学领域之间联系的详细解释。他们认为，DNA 复制和蛋白质合成之间意想不到但真实的联系存在于生命的三域中，尤其是在古细菌和真核生物中。他们相信存在着将 DNA 和蛋白质合成耦合在一起的机制。这种机制可以在（p）ppGpp（鸟苷多磷酸衍生物）和 GTP 酶或 Obg 家族的活性中找到。
- 严格应答是一种现象，可以很好地将细菌中 DNA 复制过程与蛋白质中氨基酸浓度的变化联系起来。当发生氨基酸饥饿时，观察到细胞内（p）ppGpp 浓度急剧增加，从而启动 rRNA 基因转录和蛋白质合成的关闭。然而，这个过程在不同的细菌体内有所不同。例如，在枯草芽孢杆菌系统中，氨基酸饥饿以及 rRNA 基因转录的抑制会阻断 DNA 复制的延伸步骤。在枯草芽孢杆菌中，（p）ppGpp 还会抑制 DnaG 引物酶，并可能直接影响滞后 DNA 链在自我复制过程中的冈崎片段合成。另一方面，大肠杆菌的严格应答会导致 DNA 复制起始的瞬时干扰。此类证据对于证明蛋白质与 DNA 复制过程之间的直接联系非常重要。蛋白质的氨基酸饥饿有可能阻止 DNA 复制。
- 另一个联系来源是 Obg 家族。Obg 以其将核糖体生物合成（蛋白质合成中一个关键步骤，因为蛋白质合成是通过 mRNA 在核糖体中完成的）与 DNA 复制耦合的能力而闻名。科学家们认为，核糖体生物合成与 DNA 复制之间的联系始于最初在核糖体制造中发挥作用的蛋白质。这些蛋白质参与细菌中严格应答的调节以及 DNA 复制叉的稳定。一种称为 ObgE 的 Obg 类型在控制（p）ppGpp 水平方面很有用。在 ObgE 中发现的 DNA 复制和蛋白质合成之间的一个重要联系是，ObgE 的耗竭会导致染色体分离和细胞分离问题。这项研究意义重大，因为它表明体内某些蛋白质的变化会直接影响 DNA 复制模式和生物体的遗传加工。出于这个原因，进行了 Obg 研究以证明这种蛋白质在连接 DNA 复制和蛋白质合成中所起的重要作用。
- 类似地，一个称为 NOG1（核仁 G 蛋白）的蛋白质家族也参与核糖体的制造。来自该家族的 Nog1p 属于一个复杂的复合物，其中包含许多其他直接参与 DNA 复制的蛋白质，例如 Orc6p（复制起点识别复合物）、Mcm6p、MCM 复合物的一些亚基、Yph1p 和 Rrb1p。Kilian 做出了一个非常重要的声明，即连接核糖体生物合成与 DNA 复制的蛋白质的改变会导致“染色体不稳定”和“肿瘤形成”。他还得出结论，存在一个蛋白质网络，直接将核糖体的产生与真核生物域中的 DNA 复制联系起来。
- 以上所有研究和结论仅适用于真核生物，因为尚未找到关于古细菌域的明确证据。然而，科学家们发现，存在一个基因簇，这些基因簇编码 DNA 复制和翻译蛋白。该簇包含许多基因，包括必需基因，例如 aIF-2，它是调节 DNA 复制和蛋白质合成的极佳来源。来自该簇的 eIF-2 磷酸化是真核细胞中蛋白质合成机制的主要组成部分。另一个重要组成部分是 Nop10，它在 rRNA 的发育中发挥作用。仅从检查这些组成部分就可以得出明确的结论，即蛋白质和 DNA 复制研究确实存在密切关系。一个重要的例子是 L44E 和 S27E 这两种核糖体蛋白在特殊条件下（例如之前讨论的严格应答情况下的氨基酸饥饿）会干扰 DNA 复制过程的现象。
- 总之，在古细菌和真核生物中，许多实验数据证实或表明蛋白质合成与 DNA 复制之间存在密切联系。严格应答是氨基酸饥饿如何抑制 DNA 复制起始过程的一个例子。
DNA 复制过程以“流水线”的方式进行。DNA 双螺旋被撕裂，并产生每条链的副本。许多生物酶参与其中，并且必须存在才能使这种重要作用正确发生。
当 DNA 被复制时，它会形成一个复制叉，该复制叉是在解旋酶过程中创建的，解旋酶分离了 DNA 链。分离的链被称为引导链和滞后链。引导链在 5'-3' 方向合成。它是新的 DNA 链，由 DNA 聚合酶合成。另一方面，滞后链位于对侧，从 3' 到 5' 方向延伸，由冈崎片段合成。然后，引物酶会构建 RNA 引物，允许 DNA 聚合酶利用 RNA 引物上的 3' OH 基团作用于从 5' 到 3' 方向延伸的 DNA。然后，这些 RNA 片段被新的脱氧核糖核苷酸取代，并且该链将与 DNA 连接酶连接在一起以完成链。
随着 DNA 的解旋，它会自动迫使 DNA 旋转，扭曲结构。这实际上是复制 DNA 的一个问题，因为它最终会在过度扭曲时物理上无法复制。为了解决这个问题，使用了一种称为 DNA 拓扑异构酶的酶。拓扑异构酶 I 会切断 DNA 的骨架以允许 DNA 自行解旋，而拓扑异构酶 II 会切断两条链的骨架以允许与其他 DNA 分子的相互连接，从而消除缠绕在一起的可能性。
解旋酶是沿双链核酸移动并主动解开双螺旋的马达蛋白。该酶利用 ATP 水解为 ADP 所产生的能量来解开和分离 DNA 链。这是通过破坏退火核苷酸碱基之间氢键来实现的。解旋酶打开双链可以分为两种情况：主动打开和被动打开。在主动打开的情况下，解旋酶直接破坏双链核酸 (dsNA) 以促进两条链的分离。在被动打开的情况下，解旋酶结合到由于热波动而存在的单链核酸 (ssNA) 上，从而诱导部分双链的打开。据发现，与被动打开相比，主动打开可以使 DNA 链的解旋速度提高 7 倍。这种作用的产物是两条模板链。一条被称为引导链，另一条被称为滞后链。
引导链是亲本 DNA 的单链，它连续合成而不会中断，而亲本 DNA 的滞后链则以片段的形式形成。这些片段被称为冈崎片段。这对于解释亲本 DNA 的两条链如何在 5'->3' 方向形成很重要，尽管两条链是反平行的。片段合成使 5'->3' 增长能够发生，同时似乎在 3'->5' 方向形成。
单链 DNA 结合蛋白以一种阻止新形成的两条链重新退火的方式结合到 DNA 模板上。这些蛋白使链保持分离，以便两条链都可以作为复制的模板。这使复制机制的其余部分能够就位并开始制造新的 DNA 链。
(参见 DNA 聚合酶部分)
RNA 引物酶以与解旋酶相邻的位置附着在滞后链上。RNA 引物酶在 DNA 复制中的功能是以 3' 到 5' 的方式放置 RNA 引物。这些 RNA 引物充当 DNA 聚合酶添加互补核苷酸的起始和结束位置。RNA 引物之间的核苷酸序列被称为冈崎片段。RNA 引物酶仅在滞后链中是必需的，因为 DNA 聚合酶只能在 5' 到 3' 方向添加互补碱基，而滞后链在 3' 到 5' 方向解旋。
从细菌角度看 DNA 复制酶
线粒体 DNA (mtDNA) 与核 DNA 分开维持。由于 mtDNA 的体积小，它只能拥有 37 个基因和 13 个蛋白质产物，而单倍体核基因组编码超过 20,000 个基因。然而，它可以为研究核 DNA 复制提供模型系统。人类的环状 mtDNA 基因组包含大约 16,600 个碱基对。编码的基因也被发现对于通过氧化磷酸化生成 ATP 是必要的。mtDNA 似乎没有特定的阶段进行复制，这意味着复制可以在细胞周期中反复进行。
内共生假说认为，线粒体被吞噬形成了第一个真核生物。支持这种假说的证据来自 mtDNA 本身的存在。由于线粒体曾经是自由生活的细菌，可以预期 mtDNA 维持的机制将与原核生物相比更相似。
mtDNA 复制的机制是在 1972 年通过电子显微镜发现的。所有复制的 mtDNA 分子都具有一个单链分支。这进一步导致线粒体中引导链和滞后链合成解偶联，这与核 DNA 的复制叉不同。人类 mtDNA 通常排列成共价闭合的环状结构，这些结构约为一个基因组的长度。在 mtDNA 复制中，存在一个链置换复制叉，其中引导链 DNA 合成在没有滞后链 DNA 合成的条件下发生。DNA 合成是由传统的偶联引导链和滞后链进行的。然后，延迟的滞后链 DNA 合成伴随着在滞后链上掺入 RNA，称为 RITOLS，表示整个滞后链上的 RNA 掺入。
哺乳动物如何复制其 mtDNA 的问题导致了 mtDNA 复制重现，它试图检验这样一种观点，即人类病理 mtDNA 变异的偏向性分离与复制优势有关，如酵母 mtDNA 所表明的那样。2D 琼脂糖凝胶电泳 (2D-AGE) 用于分离来自线粒体的复制中间体。这用于定义核、质粒和病毒基因组复制机制的细节。据发现，来自粗线粒体制剂的许多复制中间体对单链核酸酶敏感，正如 SDM 所预测的那样，其中一部分形成了与复制的核和原核 DNA 相关的弧线无法区分。
然而，更纯净的线粒体制剂产生了不是部分单链 DNA 而是 RNA/DNA 杂交体。这表明，早期研究中的 SDM 中间体可以通过分离和处理过程中 RNA 的丢失来解释。
总之，关于 mtDNA 复制机制仍存在争议。mtDNA 复制的链置换模型是，每条链至少有两个引物成熟事件，这同样适用于 RITOLS 复制。线粒体中 Dna2 和 Fen1 的鉴定为研究 mtDNA 复制提供了新的工具。通过操纵它们的表达并研究破坏 mtDNA 复制的突变变体，这可能被证明非常有信息量。
据发现，mtDNA 的突变、缺失和其他有问题的排列与哺乳动物的衰老呈正相关。单个细胞中突变的 mtDNA 的积累会导致呼吸链缺陷。这会导致哺乳动物的寿命缩短。当存在许多突变时，它还会导致衰老表型，例如体重减轻和脱发。 [1]
霍尔特，伊恩 J. "线粒体 DNA 复制与修复：全都是一团糟."
- 贝特顿 MD，朱丽彻 F，"解旋酶打开核酸双链：主动打开与被动打开.", 物理评论 E. 2005 年 1 月; 71 (1): 011904.
- 伯通，乔纳森，藤冈良介和帕特里克·福特雷。“当 DNA 复制和蛋白质合成结合在一起”。生物化学科学趋势。第 34 卷，第 9 期（2009 年）：429-434。细胞出版社。
- 盖大海，Y 保罗·昌和陈晓江。“DNA 复制中的起始 DNA 熔解和解旋”。结构生物学最新观点 2010 年，20:1-7。爱思唯尔。
- 查尔斯·S·麦克亨利。“从细菌角度看 DNA 复制酶”。生物化学年度评论 第 40 卷 2011 年 7 月，403-36。