结构生物化学/有机化学/纯化方法

重结晶

重结晶概述

重结晶是一种纯化方法，涉及将固体溶解在热溶剂中，过滤加热的溶液或混合物，形成晶体，以及分离结晶化合物。为了进行重结晶，必须利用化合物在热溶剂中的溶解度。在较高温度下，饱和溶液通常比相同溶质/溶剂对在较低温度下含有更多的溶质；因此，当温热的饱和溶液冷却时，溶质会沉淀出来。换句话说，较高温度下的溶液将具有更多的溶解固体，并且当它冷却时，溶质将返回到其固相，形成沉淀物。正在重结晶的固体中的杂质通常比被纯化的物质的浓度低得多，因此当混合物冷却时，杂质仍然留在溶液中，而高浓度的产物结晶。

溶质从溶液中形成晶体是一个选择性过程，因为只有以正确速度移动的固体，并在适当的浓度和溶剂条件下，才能形成几乎完美的晶体材料，因为只有具有正确形状的分子才能适合晶格。重结晶纯化化合物是因为将不纯固体溶解在合适的热溶剂中会破坏不纯化合物的晶格，并且从冷溶剂中重结晶会选择性地产生新的、更纯的晶格。缓慢冷却饱和溶液有利于形成纯晶体，因为不合适的杂质分子有时间返回溶液。缓慢形成的晶体比快速形成的晶体更大（不总是这样）并且通常更纯净，因为快速晶体形成会将杂质捕获在晶格中，因为它们只是被结晶溶质包围。重结晶最重要的方面是选择溶剂，因为溶质在热溶剂中应具有最大溶解度，而在冷溶剂中应具有最小溶解度。溶质和溶剂的关系可以用“相似相溶”来最好地描述。这意味着非离子化合物通常仅在它们可以通过氢键与水分子结合时才溶于水。烃和烷基卤化物实际上不溶于水，而羧酸和醇类通常从水溶液中重结晶。在微型重结晶实验中，遵循几个步骤来完成纯化过程。

1. 要重结晶的固体必须首先称重，然后溶解在合适的热溶剂中。
2. 必须使用重力过滤法过滤固体杂质。
3. 然后将热的重结晶混合物放置一旁冷却至室温。
4. 冷却至室温后，将溶液进一步冷却，将其放入冰水浴中 10-15 分钟，以允许进一步重结晶。
5. 为了收集晶体并完成重结晶，必须通过真空过滤收集晶体。

重结晶过程的简单描述

通过重结晶进行纯化的一个关键因素是了解溶解度。为了成功进行重结晶过程，混合物必须具有一些重要的溶解度特性。一种溶剂必须在所有温度下都可溶。下一个溶剂必须在低温下可溶。另一个溶剂必须在高温下可溶，在低温下不可溶。

这是一个简单的插图，解释了如何进行纯化过程。

蓝色正方形在所有温度下都可溶，橙色圆圈在所有温度下基本上都不溶，绿色三角形在高温下可溶，在低温下不可溶。

1. 1. 加热：如果我们加热包含正方形、圆形和三角形的混合物，正方形将已经处于溶液中，我们可以将其加热到绿色三角形溶解的程度。然后我们只剩下不溶的圆圈。

1. 2. 过滤：然后我们可以过滤含水溶解的溶液，一旦我们将它分离，我们只剩下三角形和正方形处于溶液中，而圆圈则留在前一个容器中。

1. 3. 冷却：当新分离的混合物冷却时，三角形将开始再次结晶，因为它在低温下不溶，但正方形将仍然留在溶液中，因为它在所有温度下都可溶。

1. 4. 我们分离含水层（三角形），我们剩下我们感兴趣的化合物，即三角形。

等电聚焦

等电聚焦过程

等电聚焦是一种电泳蛋白纯化过程，其中蛋白质根据其等电点进行分离。蛋白质的等电点，即pI，是在蛋白质不带净电荷时的特征 pH 值。蛋白质的净电荷由构成蛋白质的侧链的酸度或碱度决定。如果蛋白质的酸性基团多于碱性基团，则该蛋白质将具有非常低的 pH 值，被认为是酸性的。如果蛋白质在其侧链中具有比酸性基团更多的碱性基团，则蛋白质的总电荷将使其 pH 值高得多。等电聚焦利用以下步骤利用这些特性

1. 创建一个凝胶，凝胶内具有线性 pH 梯度
2. 将蛋白质样品插入凝胶中
3. 施加电场，一端为阳极 (+)，另一端为阴极 (-)
4. 留出时间让蛋白质根据其净电荷迁移到其中性 pI

凝胶的线性 pH 值允许样品任意添加，因为环境的 pH 值与电场相结合将迫使蛋白质移动，而不管它们在凝胶中的初始位置如何。蛋白质只有在施加电场后才开始迁移。在施加电场后，蛋白质会朝着与它们电荷相反的端子移动，在迁移过程中聚集或释放质子，直到它们达到其中性等电点。例如，假设所有蛋白质样品都已添加到梯度的中性 pH 位置，其中 pH=7。当电场最终施加时，蛋白质会根据其净电荷迁移。如果蛋白质的等电点为 2，则在 pH 值为 7 时，蛋白质的氢离子比它为中性（即达到其等电点）所需的氢离子少。这使蛋白质呈负电性，因此它会朝着阳极 (+) 移动，在穿过梯度到更低的 pH 值时吸收质子。当蛋白质最终吸收了足够的质子使其呈中性时，蛋白质将不再具有净电荷，并在其等电点停止迁移。

等电聚焦允许根据不同的蛋白质特征（pI）进行蛋白质纯化。因此，具有类似特征（例如分子量）的蛋白质可以通过其独特的 pI 在相当短的时间内进行纯化和分离。

升华

升华装置

升华是指物质直接从固相转变为气相，而不形成中间液相的过程。干冰就是一个例子，它从二氧化碳的固体形式直接转化为二氧化碳气体。在实验室中，升华只能在满足四个要求后才能用于纯化有机化合物。

1. 该化合物必须在不熔化的条件下汽化
2. 它必须足够稳定，能够在不分解的情况下汽化
3. 该化合物的蒸汽必须能够凝结回固体
4. 化合物内的杂质也不升华。

升华装置包括一个外容器和一个内容器。外容器容纳要纯化的样品，并连接到真空系统。被称为冷指的内容器提供了一个冷表面，汽化的化合物可以在该表面上重新凝结成固体。为了进行升华，要升华的样品必须放入一个滤瓶中。接下来，将一根内管放入烧瓶中，打开真空系统。之后，使用沙浴轻轻加热升华烧瓶，同时在内管中装满冰。在升华过程中，物质会从外容器底部消失，然后重新出现在内试管的冷外表面上。这是因为化合物在达到其升华温度时会汽化，然后由于冷却而在冷指上重新凝结。完成后，可以取出内试管，刮掉纯净固体并进行分析。

在升华过程中，需要注意不纯化合物和冷凝管之间的距离。升华装置的各部分需要足够靠近以避免分解，但又要足够远以防止污染。较大的距离意味着需要更高的温度才能保持化合物以气态形式存在，这会导致化合物分解。较小的距离会导致杂质很容易接触到冷凝管上纯化的化合物。如果不考虑距离，纯化可能无效。

蒸馏

蒸馏用于分离双组分混合物，而气相色谱法用于识别组分化合物。蒸馏是一种根据化合物蒸汽压和沸点分离化合物的技术。当两种不同的化合物被加热时，一种可能比另一种在更低的温度下沸腾。通过将沸点较低的化合物的蒸汽与另一种化合物分离，可以将蒸汽从液体中分离出来并重新冷凝，从而有效地分离两者。通过连续蒸馏，可以实现高度的纯化。一次进行的蒸馏称为简单蒸馏。虽然可以通过多次简单蒸馏实现高效率，但这将是繁琐的并且需要大量的初始样品量。然而，精馏简化了这种重复蒸馏，因为它提供了连续分离。精馏柱用于提供广阔的表面积，以便蒸汽上升和冷凝液下降之间的热交换；通过递归机制，上部蒸汽在更易挥发的化合物中更纯净，液体在更难挥发的化合物中更纯净。分离程度取决于化合物的不同沸点以及蒸馏速度、绝缘和柱效率。通过延长蒸馏时间，可以达到热平衡并获得更高的纯度。同样，绝缘可以防止热量损失以保持初始条件，而柱效率决定了可以发生多少个蒸馏“口袋”。

薄层色谱法 (TLC)

薄层色谱法 (TLC) 是一种简单快捷的分离和鉴别混合物中成分的方法。原则上，混合物中不同的成分具有不同的溶解度，并且对吸附剂的吸引力强度也不同。该方法利用了这一原理，将待分析的混合物在涂有薄层固体吸附剂的板上进行，然后将板浸入溶剂中。混合物中的成分将以不同的速度缓慢地向上移动，直到它们达到该特定溶剂和吸附剂组合的最大分离度。混合物分离成不同的彩色斑点后，将板干燥并检查成分。

技术

1. 选择用于分析混合物的溶剂，然后将其倒入烧杯中，深度小于 0.5 厘米。整个过程在烧杯中进行，并在顶部盖上表面皿，以防止溶剂蒸汽逸出。

2. 制备 TLC 板。TLC 板由薄层吸附剂制成，通常是硅胶或氧化铝。在板的底部附近，用铅笔在板上画一条线。这条线将是您点待分析混合物的起点。

3. 将板放入烧杯中，使只有板的底部浸入溶剂中。

4. 当溶剂通过毛细管作用向上移动并经过涂抹的点时，混合物中的一些成分将由于其在溶剂中的溶解度及其对板的吸附强度而以更快的速度移动。

5. 板上将出现不同的彩色斑点分离。如果斑点没有颜色，则使用紫外灯观察板。

File:Thin Layer Chromatography.JPG

1：起点 2, 3：化合物的新的位置 4：溶剂移动的距离

为了识别存在的化合物，从板上测量溶剂移动的距离和各个斑点移动的距离。使用这些测量结果，通过以下公式获得保留因子 Rf

                        Rf = (Distance traveled by the compound)/(Distance traveled by the solvent)

从 Rf 值可以预测化合物的极性。此外，该值可用于比较两种化合物。如果两种物质具有相同的 Rf 值，则它们很可能是相同的化合物。否则，它们肯定是不同的化合物。

参考文献

Mohrig, Jerry R. 有机化学技术。2006，W.H. Freeman 和公司

有机化学实验室，化学 143A