结构生物化学/聚合酶链式反应/PCR 如何进行

概述

为了进行 PCR，需要多种成分和试剂。首先，需要一个 DNA 模板，该模板包含要扩增的 DNA 区域（目标）。其次，需要与 DNA 目标两条链的 3' 端互补的正向和反向引物。这些引物可以定制设计，并可用于诱导突变。第三，需要镁 Mg²⁺ 和缓冲液以维持稳定的条件。有时可以使用锰 Mn²⁺ 代替镁。镁优于锰，因为更高浓度的锰会增加 DNA 合成过程中的错误率。缓冲溶液为 DNA 聚合酶的最佳活性提供合适的化学环境，并保持其稳定性。第四，需要脱氧核苷三磷酸 (dNTP；含有三磷酸基团的核苷酸)，供聚合酶在复制过程中使用。这是 DNA 聚合酶合成新 DNA 链的构建模块。最后，需要一种耐热聚合酶来聚合 DNA。PCR 通常在热循环仪的小反应管中，以 10-200 微升的反应体积进行。热循环仪将反应管加热和冷却到 PCR 中每个步骤所需的温度。它使用珀耳帖效应，该效应通过反转电流，允许反应管既加热又冷却。反应管的薄壁允许快速热平衡。

用 PCR 成功复制感兴趣的 DNA 可能很棘手。这是因为必须非常小心地避免污染。重要的是确保试剂充分混合并适当地储存，并根据引物和聚合酶在不同温度下的敏感性和活性选择合适的温度条件。通常，PCR 由通常 20-40 次重复的温度变化（称为循环）组成，每个循环通常包含三个步骤。执行许多循环是必要的，因为这样最终结果将主要由所需的 DNA 组成。每个循环中使用的温度和应用时间取决于用于 DNA 合成的酶、反应中二价离子和 dNTP 的浓度以及引物的熔解温度。

在将试剂混合在一起放入 PCR 管中（特殊的薄壁 Eppendorf 管，以允许热量有效传导）之后，必须对热循环仪进行编程，以进行不同的时间、温度和循环。扩增中的每个主要步骤（变性、退火和延伸）都需要与所用引物和聚合酶相适应的不同条件。第一步是初始化步骤。此步骤将反应加热至 94-98 摄氏度。该温度保持 1 到 9 分钟。这种加热 DNA 会导致 DNA 变性。热量破坏了将双链 DNA 中的氮碱基结合在一起的氢键，产生单链 DNA 分子。第二步是退火步骤，该步骤需要将温度降低至 50-65 摄氏度，以允许引物与单链 DNA 模板退火。退火温度通常比引物的熔解温度低 2-3 摄氏度。在退火步骤中，聚合酶与引物-模板杂交体结合并开始 DNA 形成。PCR 的最后一步是延伸步骤。此步骤也发生在特定温度下，具体取决于所用聚合酶。尽管一些聚合酶在略微不同的温度下表现更好，但 Taq 聚合酶通常用于 PCR，因此使用该酶时温度为 72 摄氏度。在此步骤中，DNA 聚合酶通过添加与模板互补的 dNTP 以 5' 到 3' 的方向合成一条新的与 DNA 模板链互补的 DNA 链，将 dNTP 的 5'-磷酸基团与延伸 DNA 链末端的 3'-羟基基团缩合。延伸的持续时间取决于所用的 DNA 聚合酶以及要扩增的 DNA 片段的长度。在最佳温度下，DNA 聚合酶每分钟会聚合一千个碱基。在最后一个 PCR 循环之后，需要一个最终延伸步骤来确保任何剩余的单链 DNA 完全延伸。此步骤在 70-74 摄氏度下进行 5-15 分钟。如果需要，将温度降低至 4-15 摄氏度，无限期地保持可以允许短时间储存反应。此外，有些步骤比其他步骤花费的时间更长，并且必须适当地对每个步骤进行计时。一旦建立了合适的条件，就可以设置循环次数并运行 PCR。通过这些步骤，DNA 可以方便快捷地扩增。这是因为每个 PCR 循环的产物在下一个循环中再次用作模板。然后可以对所得 DNA 进行测序以确保准确性，然后通过其他技术（如 Southern 印迹或琼脂糖凝胶电泳）进行研究。它允许对 PCR 产物进行大小分离。PCR 产物的大小通过与 DNA 梯（分子量标记）比较来确定。此 DNA 梯包含已知大小的 DNA 片段。它与 PCR 产物一起在凝胶上运行，以比较 PCR 产物的大小与 DNA 梯上的大小。

PCR 样本程序

PCR

将下面所有东西吸移到一个小管中。

40.5 цL H2O
5 цL 5x thermopol buffer
1 цL dNTP mix (10mM)
1.25 цL Forward primer
1.25 цL Reverse primer
+1 цL DNA
=50 цL rxn
+1 цL pfu Turbo polymerase (add at end. keep on ice)

放入热循环仪中（继续变性、退火和延伸步骤）。

参考文献