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结构生物化学/聚合酶链反应/PCR 的应用

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PCR 对于科学家来说是一种有用的技术,因为它允许 DNA 的扩增和突变。通过 PCR,少量 DNA 可以被指数级地复制,这不仅在成功的情况下基本上保留了样本,而且允许更大规模的研究。没有 PCR,我们能够分析的样本和我们能够诱导和研究的突变将受到我们可用于研究的 DNA 数量的限制。通过 PCR,这种 DNA 基本上是无限的,允许生物化学家对不同基因诱导各种突变以进行进一步研究。

通过定点诱变或定制引物,可以对 DNA 中的单个突变进行。通过改变通过单个突变从 DNA 转录的氨基酸,可以分析这些氨基酸相对于基因功能的重要性。但是,这个过程可能很困难,尤其是在基因协同作用的情况下(相对于基因活性而言表达不同)。运行成功 PCR 所需的时间以及在进行研究之前执行其他技术(例如蛋白质表达、分离和纯化)的时间,使得生物化学研究既耗时又困难。但是,PCR 与其他生物化学技术相结合,使我们能够分析生物体的核心以及它们发挥作用的过程。

PCR 是一种可靠的方法,可以检测与遗传疾病相关的所有突变,从插入到缺失等等。它也可以用来检测不需要的遗传物质的存在,如感染和细菌。例如,在诊断艾滋病等疾病时,PCR 可用于检测感染 HIV 的少量细胞。PCR 还允许早期诊断诸如白血病等不需要的疾病。PCR 提供了一种非常简单快捷的替代方法。

研究中的 PCR 例子

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由 Nisha Patel,UCSD 儿科,Sander 实验室运行的 PCR

PCR 是一种高度常用且广泛用于研究的工具,它允许研究人员通过简单的反应来扩增 DNA 片段,这些反应可以在一小时内完成。研究中的 PCR 最常用于测试体内基因表达。这些例子包括小鼠 DNA 的 PCR,以确定小鼠携带的基因。可以对这些带有特定靶基因的小鼠进行研究,以观察这些基因的生物学效应。当今实验室中常见的 PCR 协议包括敲除基因分型、荧光基因分型和突变基因分型。研究人员可以使用 PCR 作为一种搜索基因的方法,方法是使用 flanking 目标基因序列的引物以及 PCR 所需的所有其他组分。如果基因存在,引物将结合并扩增 DNA,在将要运行的琼脂糖凝胶上产生扩增 DNA 带。如果基因不存在,引物将不会退火,也不会发生扩增。扩增可以在 DNA 中的多个位置发生,这就是为什么研究人员可以使用 DNA 梯子来比较扩增链的相对长度(通常以 bp 为单位)。如果基因的长度已知,那么研究人员将知道要寻找哪些带以及可能忽略哪些带。使用“可能忽略”一词是因为 PCR 通常与正在研究的 DNA 以及对照一起运行,对照可以包括基因阳性的 DNA、基因阴性的 DNA 以及除 DNA 之外的 PCR 反应中的所有反应物。如果在 DNA 阴性和仅反应物反应中以及所有其他反应中都存在基因阳性带,则理解一些反应物被阳性 DNA 污染,因此应将其丢弃并重新运行 PCR。

这是一个使用 PCR 反应产物运行的凝胶的示例。最左侧的列是 100bp 梯子,它跟踪 100、200、300 等碱基对片段的移动。每个孔代表从一只小鼠身上提取的 DNA。如图片所示,一些小鼠缺少一种会被引物扩增的 DNA 序列。在这里可以看到 PCR 在识别小鼠中针对 DNA 的靶序列方面的强大工具。由于可以区分不同遗传背景的小鼠,因此可以对某些基因做出进一步的结论。

PCR 应用

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PCR 可用于分离基因组 DNA。这意味着 PCR 可以通过扩增亲本 DNA 链的特定区域来从基因组 DNA 中分离 DNA 片段。PCR 的应用包括生成用于 Southern 和 Northern 杂交、DNA 克隆、DNA 测序、遗传指纹等杂交探针。

法医学个人的 DNA 图谱非常独特。多个基因的 PCR 扩增正在用于在亲子鉴定案件中确定生物学亲子关系。通过 PCR 分析血迹和精液样本已经确定了大量袭击和强奸案件中的罪责或无罪。在犯罪现场发现的单个脱落毛发或皮肤的根部包含足够的 DNA,可以通过 PCR 进行分型。PCR 的强大之处在于,该过程只需要很少的 DNA 链,因为扩增以指数级进行。PCR 也不需要了解目标 DNA 序列,而只需要了解 flanking DNA 序列。

进化论由于 DNA 的稳定性,大量的 DNA 片段可以保存数千年。因此,PCR 是将古代 DNA 分子扩增用于进化研究的理想选择。PCR 还可用于扩增尚未分离的微生物的 DNA。

PCR 扩增

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PCR 可以分析极少量的 DNA 样本,并可以扩增 DNA 的目标区域。

定量 PCR

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定量 PCR 是一种可以估计样本中将显示的序列量的方法;这通常用于定量确定基因表达水平。实时 PCR 是一种用于 DNA 定量的工具,它在每个 PCR 扩增循环后测量 DNA 产物。

PCR 用于诊断疾病

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恶性肿瘤(如白血病)的 PCR 诊断在癌症研究中被常规使用。当直接在基因组 DNA 上进行时,PCR 检测可以比任何其他方法检测到更高的恶性细胞。该技术可以识别某些生长控制基因(如 ras 基因)的突变。能够极大地扩增 DNA 的选定区域在监测癌症化疗中也具有很高的信息量。PCR 测试可以检测出癌细胞何时被消除,以及检测复发。

PCR 可以揭示那些尚未对这种病原体产生免疫反应的人体内是否存在人类免疫缺陷病毒(否则会通过抗体检测错过)。

在组织样本中发现结核分枝杆菌缓慢且费力,但使用 PCR,每百万个人类细胞中只有 10 个结核杆菌就可以很容易地检测到。

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