结构生物化学/蛋白质/酶联免疫吸附测定 (ELISA)
酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种分析方法，利用各种 抗体 检测湿样或液体样品中化合物的存在。 酶 与抗体结合，与底物反应，产生颜色变化，表明所需物质（通常是抗原）的存在。颜色强度可用于确定样品中目标物质的浓度。抗体被分析以形成仅检测所需抗原或蛋白质的单克隆抗体纯系。
如果抗体标记的酶对另一种抗体具有特异性，则使用间接 ELISA 方法，而如果抗体标记的酶可以直接与抗原反应，则优选使用夹心法。
- 目的：检测一种类型的抗体的存在。
- 步骤
- 用抗原包被样品孔。
- 将样品添加到包被孔中。如果样品中存在目标抗体 (抗体 A)，它将与抗原结合。洗去剩余的样品。
- 将第二抗体 (抗体 B) 添加到样品中。抗体 B 是一种专门与抗体 A 结合的抗体，并与特殊酶相连。洗去剩余的抗体 B。
- 将底物添加到混合物中。这种底物将触发与连接到抗体 B 的酶的反应，产生有色物质。
- 颜色变化的速度与溶液中抗体的量成正比。
- 用途：HIV 感染测试
在夹心 ELISA 或双位点捕获测定中，使用两种不同的抗体。孔用针对抗原的一个区域的特异性抗体包被，然后添加含有抗原的测试溶液。洗涤后，将识别抗原不同表位的第二抗体添加。这种抗体将与酶连接。
- 目的：检测一种类型的抗原的存在。
- 步骤
- 用对一种类型的抗原有特异性反应的单克隆抗体 (抗体 Z) 包被样品孔。
- 将可能含有目标抗原 (抗原 C) 的样品添加到包被的样品孔中。如果样品含有抗原 C，它将与抗体 Z 结合。洗去剩余的样品。
- 将第二种单克隆抗体 (抗体 Y) 添加到孔中，该抗体也与抗原 C 结合。这种抗体与特殊酶相连。
- 添加与抗体 Y 上的酶反应的底物。发生反应并观察到颜色变化。
- 有色产物的存在证实了抗原 C 的存在。有色产物的强度可用于确定抗原 C 的浓度。此外，溶液的颜色变化速率与抗原的量成正比。
- 夹心 ELISA 的应用：妊娠测试
在妊娠测试中，反应区将包含识别妊娠激素称为人绒毛膜促性腺激素 (HCG) 的独特β链一部分的主要抗体（通常是单克隆小鼠抗体 IgG）。测试区中与酶结合的二级抗体识别α链。这种链可以在非孕妇妇女中发现的黄体生成素 (LH) 中发现。如果抗原与两种抗体结合形成夹心，它将在该测试区显示颜色变化。最后，对照区含有与主要抗体（抗 IgG）结合的抗体。该区出现颜色变化将表明我们的测试已正确执行。
竞争性 ELISA 是另一种 ELISA 方法，它涉及竞争性结合过程。
- 步骤
- 在抗原存在的情况下孵育未标记的抗体。
- 将结合的抗体/抗原添加到抗原包被的孔中。
- 洗涤并去除未结合的抗体。
- 竞争源于这样一个事实：样品中存在的抗原越多，能够结合的抗体就越少。
- 添加与酶偶联的第二抗体。
- 添加底物以产生信号
- 释放的信号越弱（颜色或荧光信号），表明原始抗原浓度越高。
反向 ELISA 是一种相对较新的技术，专门用于研究西尼罗病毒包膜蛋白以及它如何检测病毒特异性抗体。这种较新的技术使用由具有 ogives 的免疫吸附聚苯乙烯棒制成的固相。将整个装置浸入含有收集的样品的试管中，然后执行以下常规步骤，例如洗涤、在结合物中孵育和在显色剂中孵育，方法是将微孔浸入含有制备的样品浓度的溶液中。
反向 ELISA 相对于其他 ELISA 技术的优势在于该测试能够检测不同试剂的灵敏度，这对于检测具有大目标检测的不同类型的抗体及其各自的抗原非常有利。可以增加样品量以提高临床（唾液、尿液）、食品（散装牛奶、混合鸡蛋）和环境（水）样品的测试灵敏度。留出一个 ogive 不敏感，以测量样品的非特异性反应。无需使用实验室用品来分配样品等份、洗涤液和试剂到微孔中，从而简化了即用型实验室试剂盒和现场试剂盒。基于 ELISA 平台，该方法使用抗体微阵列来捕获天然抗原。然后通过对患者 IgG 进行差异标记，并将这些抗体与固定在抗体微阵列上的天然抗原一起孵育来评估自身抗体的反应性。
- 步骤
- 准备：准备从血清中分离和纯化的自身抗体 (IgG)。通过放射性标记或荧光染料对它们进行标记。
- 提取：用阵列上的天然蛋白质标记自身抗体。通过独特的单克隆抗体从微阵列中提取与阵列上抗体结合的天然抗原。应将阵列与天然蛋白质提取物（如细胞、组织或体液等）一起孵育。
- 分析：根据出现在测定中的染料的强度分析浓度。当过程完成后，然后通过其颜色强度评估测定，该颜色强度是针对每个孔确定的。产生的颜色量与结合到微孔底部的蛋白质上的主要抗体量相关。