结构生物化学/蛋白质/荧光标记
荧光标记，有时被称为荧光团，是任何能够吸收光并在某些特定波长处发射光的分子。荧光团的类型多种多样，从简单的有机化合物到像绿色荧光蛋白这样的大型蛋白质。荧光标记使我们能够在生物环境中研究蛋白质。当特定波长的光照射到分子的生色团时，光子被吸收并激发电子到更高的能级。然后，电子回到基态。释放的能量由公式 E = hν 决定，其中 h 是普朗克常数，ν 是光子的频率。这种能量可以与发射光子的波长相关联，它对应于可见光谱上的特定颜色。吸收波长和发射波长之间的差异称为斯托克斯位移。大的斯托克斯位移通常是理想的，因为来自荧光标记的发射光可以更容易地从激发光中过滤出来。如 FITC（异硫氰酸荧光素）等荧光诱导分子被用于染色细胞，这使得能够在荧光显微镜下观察这些细胞。多种荧光标记可用于染色细胞的不同部分。荧光显微镜可以帮助确定特定蛋白质在细胞中的位置。人们甚至可以跟踪这些蛋白质的运动，并推断出这些目标蛋白质的可能功能。
绿色荧光蛋白（GFP）是一种荧光蛋白，存在于水母Aequoria victoria中。在生物化学中，它经常被用作标记来监测基因表达和细胞分裂。天然存在的 GFP 在 395 nm 处有一个主要吸收峰，在 475 nm 处有一个次要吸收峰。它有一个 508 nm 的发射峰。这意味着当暴露在蓝光下时，它会发射发出绿光的 photons，因此得名绿色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白由 238 个氨基酸组成。它呈桶状，称为 β-桶，由 11 个 β-链形成蛋白质的壁，一个 α-螺旋贯穿中心。β-桶的直径为 30Å，长度为 40Å。在分子中心是疏水性荧光团，它是蛋白质中负责吸收和发射光的部分。荧光团由三个氨基酸组成：丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸，分别位于 65、66 和 67 位。[1]
为了使用荧光显微镜观察目标蛋白，必须将 GFP 的基因剪接到编码目标蛋白的 RNA 转录本中。无论该基因在何处表达以产生这种蛋白质，GFP 将与其一起产生。这些目标蛋白现在在荧光显微镜下观察时会发出荧光。
荧光团在催化过程中通过顺序机制产生。催化反应的激活不需要辅助因子。反应由 Ser65 和 Gly67 之间的快速环化启动，形成咪唑啉-5-酮中间体，然后是 Tyr66 侧链被 O2 氧化的速度更慢的限速步骤，时间尺度为数小时。Gly67 是形成荧光团所必需的，没有其他氨基酸可以替代该位置的 Gly。此处的反应对热敏感。当温度升高到 30oC 以上时，荧光团的形成率会下降。一旦 GFP 产生，GFP 就会转变为热稳定的状态。
当荧光分子被引入基因组时，它们往往具有光毒性，这会导致细胞在荧光分子活性时死亡。大多数小的荧光分子都具有一定程度的光毒性，例如 FITC（异硫氰酸荧光素）。由于 GFP 的三肽荧光团是由氧气激活的，因此不需要添加酶。这种氧气激活特性使目标细胞受到的干扰较少，从而导致 GFP 在活细胞中使用时危害较小。这使得 GFP 可以维持在基因组中。
另一种用于定位蛋白质的方法是将 GFP 与抗体结合，该抗体将与目标蛋白质结合。直接方法将荧光抗体与目标蛋白质上的相应抗原结合。间接方法首先在目标蛋白质上结合非荧光抗体。然后引入荧光抗体，它将与非荧光抗体结合。尽管可以直接染色细胞的特定部分，但由于亲和力高，间接方法是优选的。然后使用荧光显微镜，可以研究现在发光的目标细胞。
GFP 的应用不仅限于监测基因表达和细胞调节。锌和一氧化氮等无机物质是帮助驱动生理过程的重要物质。因此，研究和可视化这些无机物质如何在细胞内相互作用和被加工非常有价值。对于锌，有许多开启传感器提供了在细胞内可视化锌离子的良好方法。大多数使用的锌指示剂是基于强度的传感器，因此对锌指示剂的响应建立了荧光发射的强度。另一方面，一氧化氮由于其气态性质、有限的水溶性和其他限制，更难以监测。解决此挑战的一种方法是使用对一氧化氮敏感的蛋白质的遗传编码，这些蛋白质具有过渡金属一氧化氮反应位点。例如，将两个突变的 GFP 融合在一起用作一氧化氮指示剂。从某种意义上说，人们可以操纵 GFP 用作指示剂，从而为理解信号网络的组织和调节提供更多可能性。[2]
绿色荧光蛋白也用于 FRET（荧光共振能量转移）的体内技术，这是一种用于理解蛋白质之间相互作用的成像方法。在 FRET 中，测量了来自荧光蛋白（“供体”）到另一个波长更长的荧光蛋白（“受体”）的能量转移。通过测量与 GFP 结合的蛋白质之间的分子间和分子内距离，研究人员能够观察和记录蛋白质的相互作用。例如，FRET 使我们能够检测信号分子之间的相互作用。通过将对 FRET 供体和受体蛋白质之间的构象变化敏感的蛋白质定位在 FRET 供体和受体蛋白质之间，我们可以确定该途径的活性。[3]
基于金属的荧光探针已被开发为一种检测系统中 NO 的存在的方法；NO 是一种与生物体中的信号通路相关的突出化合物。这些基于金属的荧光指示剂基于金属 Cu(II)。当 Cu(II) 离子与 NO 反应时，Cu(II) 被还原为 Cu(I)。这个过程导致一氧化氮氮原子上的孤对电子的猝灭能量减少；反应导致氮原子上的孤对电子的荧光强度降低。此外，系统中发生的 Cu(II) 与 NO 之间的反应也导致 N-亚硝胺中 PET 猝灭的降低。基于 Cu(II) 的荧光探针非常适合检测存在于不含氧环境中的 NO。一种特定利用 Cu(II) 离子识别 NO 的荧光素染料是 CuFL1 平台。该特定支架中的荧光素染料具有氨基喹啉（喹啉的衍生物），它与 Cu(II) 结合并形成 16 倍的发射开启。该反应将氨基喹啉的仲胺转化为 N-亚硝基化产物，这加强了分子的荧光；荧光强度的增加基于 NO 的浓度。CuFL 探针已经确定了 Raw 264.7 巨噬细胞和某些革兰氏阳性细胞（如枯草芽孢杆菌和炭疽杆菌）中 NO 的存在。[4]
荧光标记物常用于 DNA 研究中，以确定链中碱基的序列。这种方法的优点是不像西方印迹中那样使用放射性试剂进行自显影。因此，它已成为一种非常流行的 DNA 测序方法。在弗雷德里克·桑格及其同事设计的一种方法中，使用 DNA 聚合酶在四种放射性标记核苷酸的混合物中创建单链 DNA 分子的互补链。该合成中包含了一种混合物，其中包含核苷酸的 2',3'-二脱氧类似物，每种混合物使用不同的类似物。混合物中的 2',3'-二脱氧类似物会导致 DNA 复制终止，从而产生片段。这是因为该类似物没有 3' 羟基末端以促进磷酸二酯键合。然后，这些混合物进行电泳，通过放射自显影图读取碱基序列。使用荧光标记物，在二脱氧类似物中将不同的彩色标签附着到每个碱基上，而不是进行放射性标记。然后，这些片段进行相同的电泳。通过其荧光检测所得条带，颜色序列随后被翻译成碱基序列。使用这种方法，现代测序工具每天可以测序超过 100 万个碱基。[5]
荧光蛋白报告基因
[edit | edit source]正在开发荧光蛋白 (FP) 报告基因的策略，这些策略“讲”细胞的语言，使科学家能够了解以前无法观察到的复杂生化过程网络。目前制造了三种主要类型的 FP。第一种是与蛋白质结合以报告其位置和周转的 FP；第二种是旨在改变荧光信号的 FP，使科学家能够知道何时发生了变化或与他们正在研究的蛋白质之间的分子间相互作用。最后，还有一些 FP 包含一个感觉元件，可以检测小分子的积累或降解。然后使用这些 FP 报告基因来了解标记的信号分子的行为及其时空组织。
在正常的信号通路中，质膜上的受体检测细胞外信号并介导细胞内第二信使的产生，这些第二信使然后调节信号酶和下游转录因子的活性。这些报告基因使科学家能够观察蛋白质在其自然环境中的反应，无论它是否穿过膜扩散或需要膜上的受体来发送信息。可以使用 GFP 观察这些，GFP 的荧光随时间推移会改变颜色，或者可以光激活。这种方法允许直接显示细胞内负责观察到的作用的分子。FP 的最大好处是它们能够保持离散并且不干扰细胞功能的通路。[6]
量子点
[edit | edit source]参考资料
[edit | edit source]- ↑ Tsien，Roger Y. "绿色荧光蛋白。”Annu. Rev. Biochem. 67 (1998): 509-44。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用荧光成像进行细胞功能的新兴体内分析。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 327-332。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用荧光成像进行细胞功能的新兴体内分析。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 329-330。
- ↑ Pluth，M.D；Tomat，E.；Lippard，S. J. 荧光传感器揭示了移动锌和一氧化氮的生物化学。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 333-355。
- ↑ Berg，Jeremy M.，Lubert Stryer 和 John L. Tymoczko。生物化学。第 6 版。波士顿：W. H. Freeman & Company，2007 年。138-139。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用荧光成像进行细胞功能的新兴体内分析。"Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 327-332。