结构生物化学/蛋白质/蛋白质结构测定方法
有许多方法可以用来确定蛋白质的结构。
X射线晶体学是一种实验技术，用于确定分子的结构。X射线晶体学之所以有效，是因为用于研究样品的X射线辐射的波长足够短，能够识别分子的特征。将感兴趣的样本分离、纯化并结晶，然后用X射线束照射晶体样本。X射线光子的路径根据构成晶体结构的分子结构而发生扰动，X射线路径被捕获在晶体样本后面的感光纸上。分析X射线在感光纸上形成的图案，可以推断出分子的结构。
由于X射线晶体学和核磁共振需要大量（约毫克级）的纯化蛋白质（在当前的纯化技术中，由于复杂性，通常无法获得）来分析蛋白质的结构，因此通常采用重组技术，通过操纵宿主生物体表达要研究的蛋白质。通常，需要使用蛋白质重折叠方法，因为蛋白质不能正确折叠，并且蛋白质结构中会发生称为包涵体的异常情况。为了获得正确折叠的蛋白质，必须去除异常情况；将蛋白质变性然后重折叠到其正确的结构。因此，可以利用X射线晶体学或核磁共振研究重折叠的蛋白质。已知蛋白质的结构和功能分析证实，该方法与直接从其天然来源研究蛋白质相当。
将蛋白质溶液置于磁场中，并测量不同射频对蛋白质中不同原子共振的影响。蛋白质必须小（~120个残基）且必须可溶才能使用这种方法。从头算方法、同源建模和折叠识别也是用于确定蛋白质三级结构的其他常用方法。
这种方法可以在液氮温度或低于液氮温度下进行，可以创建可视化效果。它是一种相当新的技术，可以以极高的分辨率创建可视化效果。该方法是一种电子显微镜形式，利用极低的温度来减少标本辐射损伤的发生。
从头算方法用于从第一性原理预测蛋白质的三级结构。它基于热力学假设，该假设预测蛋白质的天然构象对应于蛋白质/溶剂系统的全局自由能最小值。同源建模是一类从氨基酸序列构建蛋白质原子分辨率模型的方法。它的动机是，如果序列相似性很高，那么结构相似性也可能很高。几乎所有同源建模技术都依赖于识别一个或多个可能与查询序列结构相似的已知蛋白质结构，以及生成将查询序列中的残基映射到模板序列中的残基的对齐方式。然后使用序列比对和模板结构来生成目标的结构模型。由于蛋白质结构比DNA序列更保守，因此可检测到的序列相似性水平通常意味着显著的结构相似性。
硬X射线荧光（XRF）显微镜是一种强大的结构可视化方法。它检测生物系统中金属分布的痕迹，如Cu和Zn。它可以同时映射10-15种元素，从而生成准确的元素共定位图。微量元素对大多数生命形式都很重要。金属通过催化功能或结构作用在许多蛋白质中发挥着重要作用。金属也被认为会影响人类健康和疾病。
X射线荧光适用于定量分析微量元素。X射线荧光可以通过X射线束或通过暴露于质子或电子等粒子来激发。这有助于以高空间分辨率映射元素含量。X射线微探针具有区域板、Kirkpatrick-Baez 镜、复合折射透镜和锥形毛细管，具有不同的探针尺寸和光强度。
断层扫描（称为切片成像）是一种二维技术，对许多相邻切片一起进行，从而形成三维重建。XRF还使用了全场成像和结构检测方法。这些技术具有混合优势和劣势，具有不同的空间分辨率、灵敏度和不同的元素对比度。投影断层扫描使用标本的投影作为断层扫描重建算法的输入数据。但是，X射线荧光显微照片并不完全等同于投影成像，因为存在自吸收效应，包括入射光束的吸收和荧光的重新吸收。较厚的生物组织中的较重金属已成功地使用背投影而无需校正。共聚焦断层扫描是一种直接空间方法，用于扫描XRF断层扫描，轴向分辨率达到5微米以下。准直器或透镜限制了能量色散检测器的视场，因此信号仅来自照射柱的小部分。然后将探针体积减小到球体，并通过在三个维度上扫描标本穿过探针体积来映射元素分布。共聚焦几何结构也允许直接访问标本的小区域；但是，针对感兴趣的特征可能非常困难。
自吸收在XRF断层扫描中起着重要作用，因此需要良好的校正算法以确保图像保真度，以扩展标本尺寸域，扩展元素域并保持定量数据精度。
在软 X 射线断层扫描中，样品的投影图像是在围绕旋转或“倾斜”轴的不同角度收集的，这在数学上能够被计算以重建样品。在三维断层扫描中遇到的一个问题是，生物材料在暴露于 X 射线显微镜中的强光（来自光子或荧光显微镜中的紫外线照射）时会受到损坏。然而，在软 X 射线断层扫描中，图像集合以 1-2 度的增量在 180 度旋转中获取。这会导致样品因接收大量辐射而发生结构性损坏。然而，样品的冷冻固定避免了这个问题。当细胞在液氮温度下成像时，可以收集超过一千张软 X 射线投影图像，而没有明显的辐射损伤迹象。
水窗软 X 射线断层扫描的主要优势在于它可以应用于细胞生物学中的任何成像研究，例如成像简单的细菌、酵母和藻类、高级真核细胞和组织。这些图像还保持真核细胞处于原始状态，无需使用染色剂或标记物，这是光学显微镜或电子显微镜无法做到的。
电子断层扫描，也称为 ET，是一种新型的可视化技术，它可以做到其他结构测定方法无法做到的事情，即这种方法能够弥合超分子结构的原子结构信息与其细胞事件之间的差距。它不仅可以可视化分子的结构，还可以可视化它与其他结构和细胞器的关联。例如，电子断层扫描为观察病毒在宿主细胞中的传播和病毒生命周期打开了大门。断层扫描切片可以检查病毒附着到细胞、穿透细胞、移动到复制位点、组装子代病毒并将其运送到膜区域以及从细胞中出来的分子结构。虽然这项技术仍然很新，但它已经应用于人类和猴免疫缺陷病毒（HIV 和 SIV）以及感染植物、动物和人类的其他病毒。
以下是通过使用电子断层扫描观察和阐明的细胞事件的示例。
1) 病毒进入：ET 显示存在“进入爪”，这是病毒与宿主细胞接触的特征结构。进入爪由五到七根杆组成，代表了病毒刺突与细胞表面受体之间的相互作用。此外，CT 显示，一些细胞，例如痘苗病毒感染的细胞，在细胞入侵前后显示出痘苗病毒形状的明显变化。
2) 病毒工厂：ET 揭示了更多关于病毒颗粒的知识，病毒颗粒是位于病毒复制位点的包涵体，负责病毒组装和复制。ET 支持了在病毒颗粒内部发现核心蛋白 P1、P3、P5 和 P7 以及外部衣壳蛋白 P2、P8 和 P9，以及病毒颗粒围绕病毒颗粒的形成。有了这些信息，科学家能够提出一个三步病毒复制过程：1) 在病毒颗粒内部形成核心颗粒，2) 核心颗粒在病毒颗粒周边用外部衣壳包被，以及 3) 通过微管将成熟的病毒运输到膜区域。
3) 病毒颗粒在细胞内的运输：提出的病毒复制过程的第三步通过 ET 观察并得到证实。病毒在初始位点传播后，会移动到另一个位点进行二次繁殖。这种向另一个位点的移动是通过病毒利用丝状物质（如由肌动蛋白和 β 微管蛋白组成的微丝和微管 (MT)）发生的。ET 允许可视化胞质运输机制，并强烈暗示微管有助于将新组装的病毒运输到膜，从而导致病毒在细胞之间的传播。这表明微管有助于细胞之间的传播，而不是病毒进入复制位点。最后，ET 显示了病毒和微管之间的间隙，表明病毒颗粒不直接与微管相互作用。相反，间隙中充满了杆状结构，该结构可能充当正端定向马达。
总之，ET 显示出比其他结构测定方法具有两方面的优势。首先，ET 可以防止基于二维结构的误导性结论。其次，观察细胞和病毒中更精细的结构可以阐明病毒颗粒在与微管相关的详细组织。这只有使用 ET 才能观察到。
在软 X 射线显微镜中，第三代同步加速器用作 X 射线源。软 X 射线投影图像是由精密纳米结构 X 射线透镜、高效直接检测 CCD 相机以及设计良好的透射 X 射线显微镜产生的。图像使用相位对比技术生成。
软 X 射线显微镜使用能量处于“水窗”范围内的光子进行操作，该范围是位于碳和氧的 K 层吸收边之间的光谱区域。细胞水保持透明，因为细胞中的结构根据生化成分和密度进行可视化。脂滴是比水含量高的细胞器（如液泡）吸收更多光的结构。
病毒感染细胞超分子结构的电子断层扫描。岩崎健二和大村利浩。
- ↑ Hiller, S., Abramson, J., Mannella, C., Wagner, G., and Zeth, K., "The 3D structures of VDAC represent a native conformation," Trends in Biochemical Sciences, 2010.