蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱/亲和
章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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亲和色谱是一种生物化学方法，旨在从混合样品中分离蛋白质。它是最常用的技术之一，因为它在分离蛋白质方面非常选择性和有效。该技术依赖于分子与固定在基质上的配体之间的独特相互作用。亲和色谱已应用于各种应用中，几种类型的基质可随时获得，并可从各种供应商处购买。这些基质包括以下相互作用：
| 分子 | 配体 |
| 抗原 | 抗体 |
| 酶 | 底物 |
| 受体 | 配体 |
| 核酸结合蛋白 | 核酸 |
| 多糖、糖蛋白 | 凝集素 |
亲和色谱已成功用于许多蛋白质标签，最常见的应用之一是使用多组氨酸标签。从基因产物中提取蛋白质可能是一项艰巨的任务；一种常用的策略是在基因末端附近设计一个多组氨酸标签。通常，组氨酸标签相对较短，不会干扰蛋白质构象。在亲和色谱中，多组氨酸标签将结合到柱中的镍树脂。
开发有效的亲和色谱方法涉及
- 寻找足够特异性的配体
- 寻找目标蛋白与配体之间结合以及释放蛋白的合适条件。
亲和色谱过程可以分为 3 个主要步骤
- 平衡
- 样品应用
- 洗脱
亲和色谱的第一步是通过将两个识别成分之一固定在不溶性疏水性聚合物（如琼脂糖）上，来制备固定相。
然后将含有另一个识别成分的粗提物应用于该固定相。只有那些被固定相吸引的成分会结合到柱上，其余的成分会直接通过柱子洗涤。该步骤的成功高度依赖于目标分子足够结合到配体的能力。平衡解离常数 (KD) 是一个量化目标蛋白与其配体之间键合强度的值。KD 值越低，键合越强。KD 值在 10-4 到 10-6 之间对于目标分子结合到固定相是理想的。
如果 KD 值过高，目标蛋白会泄漏。如果 KD 值过低，目标蛋白会结合得太牢固。这可能会导致目标蛋白“不可逆”地吸附到固定相上。虽然在这种情况下，吸附并非真正不可逆，但所需的洗脱条件可能非常苛刻，并可能破坏蛋白质的功能。
在洗涤步骤中，通常包括高浓度盐以克服较弱的识别相互作用，除那些紧密结合到固定相的蛋白质外，所有蛋白质都被洗脱。
洗涤后进行洗脱步骤，在洗脱步骤中，使用固定化配体的可溶性形式来将结合的蛋白质从固定相上置换下来。
由于只有特定的目标样品可以结合到固定相，因此不需要精细调节的洗脱梯度。在亲和色谱中，可以简单地立即从结合条件切换到释放条件。
从固定相上洗脱目标分子有两种可能的方法
- 将 KD 值从低变为高。洗脱的理想 KD 值通常在 10-1 到 10-2 之间。可以通过改变条件（如盐浓度、pH 值、温度等）来改变 KD 值。
- 添加一个竞争者，它会将目标蛋白从配体上置换下来。这可能涉及添加游离配体，它会结合到目标蛋白上并与蛋白一起洗脱，或者可以是一个结合到配体上并代替目标蛋白的竞争者（图 2 和 3）。
亲和色谱中可以使用三组目标分子
- 基于生物活性的特异性结合：这些包括受体结合位点、抗体结合位点和酶活性位点。这些与它们天然存在的配体或这些配体的类似物一起使用。如果配体类似物具有广泛的特异性，则可以使用这些类似物分离分子组。
- 天然存在的辅基：多糖就是这类物质的一个例子。这通常只在进行组分离时有用。
- 经过工程改造的包含亲和标签的分子：常见的标签示例包括 GST（谷胱甘肽-S-转移酶）或具有可访问的组氨酸残基的蛋白质。这些亲和标签几乎总是被设计到重组蛋白中，目的是为了分离。
当使用单特异性配体时，很难找到针对每个案例的市售基质。公司通常销售“活化凝胶”，这些凝胶具有可与配体偶联的活性残基。在组特异性色谱实验中使用的配体通常可以在市面上买到，因为它们更广泛适用。
较小的配体可能会导致一些问题。可能出现的一个问题是空间位阻。可能发生的另一个问题是配体的通路被阻断，如图 4 所示。间隔臂可以解决这个问题。
- Davidson.edu 亲和色谱方法
- GE Healthcare 亲和色谱动画 || 亲和与产品介绍
- Craig, P. 亲和色谱
- EYLaboratories, Inc - 各种配体清单
- 亲和图像
- Bio-Rad 亲和色谱与产品
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