蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱法/分子排阻
章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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分子排阻 /凝胶过滤 /凝胶渗透 /尺寸排阻 是最简单的分离分子机制之一。该方法根据蛋白质的大小分离蛋白质。固定相填充了具有各种孔径的多孔珠子。当将蛋白质混合物引入柱中时，从小到大、中到大各种大小的蛋白质将被过滤通过柱子。
- 小蛋白质可以适合任何孔径并进入许多孔径，然后才能到达柱子末端。因此，小蛋白质的运动受到极大阻碍，导致它们最后从 SEC 中洗脱出来。
- 中等大小的蛋白质可能适合一些孔径，但不适合所有孔径。这些蛋白质通常将在小蛋白质和大蛋白质之间洗脱出来。
- 大蛋白质无法进入珠子。它们在柱中的运动不受珠子的阻碍，这使得它们成为第一个从柱子中洗脱的蛋白质。
在实践中，凝胶过滤可用于在蛋白质纯化过程中的任何阶段根据分子量分离蛋白质。它也可以用于缓冲液交换 -溶解在 pH 4.8 醋酸钠缓冲液中的蛋白质可以被应用于已用 pH 8.0 磷酸三钠缓冲液平衡的凝胶过滤柱。使用 pH 8.0 磷酸三钠缓冲液作为流动相，蛋白质在穿过柱子时进入磷酸三钠流动相，而比蛋白质小得多的醋酸钠缓冲液分子完全包含在多孔珠子中，并且比蛋白质移动得慢得多。
实现高分辨率蛋白质分离主要取决于两个因素
- 足够的 选择性：创造条件，在样品区之间产生足够的空间
- 足够的效率：抵消“区域扩散效应”
分辨率可以用以下公式表示：
Vr1 和 Vr2：两个相邻峰的洗脱体积。因此，Vr2-Vr1 代表两个峰之间的距离。
W1 和 W2：峰的宽度
分辨率公式的分子代表选择性或色谱图中两条不同曲线之间的距离。当距离太短时，两条相邻的曲线可能会开始合并，导致两种蛋白质的分离不充分。选择性由两个因素控制：实际介质的选择性和柱子的长度。
不同的流动相介质具有不同的选择性曲线。有些介质提供高选择性，而另一些介质提供低选择性。选择哪种介质通常反映了被分离蛋白质的类型和大小。
柱子的长度也对选择性有影响。分子排阻不涉及任何梯度；因此，分子将以相当恒定的速率沿着柱子移动。如果两个分子以不同的速率移动，则增加移动距离将随后增加两个分子之间的距离。增加柱子的长度是提高分辨率的一种方法。然而，需要注意的是，随着柱子长度的增加，样品区会变宽。这种区域扩散效应会抵消一些获得的分辨率。
提高效率包括抵消区域扩散效应。理想情况下，特定蛋白质的所有样品应该同时到达柱子末端；但是，一些因素会影响发生的区域扩散程度。其中两个最重要的因素是：珠子的均匀性和珠子的尺寸以及流速。
在柱子中，珠子必须保持均匀性。不规则性会导致样品的不同部分以不同的速度沿着柱子移动。样品到达柱子末端的总时间范围会变大，这不是理想的。
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