蛋白质组学/蛋白质分离 - 色谱/离子交换
章节作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章节修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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离子交换可能是最常用的用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸、多核苷酸和其他带电生物分子的色谱技术（参考文献1）。离子交换成功的原因为其广泛的适用性、高分离能力、高容量以及方法的简单性和可控性 (参考文献2)
与其他形式的色谱一样，离子交换色谱也利用固定相和流动相。此方法中的固定相带有正电荷或负电荷。带电固定相根据与其结合的带电粒子的类型命名。
阴离子交换的固定相由合成聚合物（树脂）组成，该聚合物包含许多带正电荷的功能基团，通常是季铵离子。带负电荷的物质会被树脂吸引，并沿色谱柱缓慢移动。类似地，带正电荷的物质会被阳离子交换树脂的带负电荷的功能基团吸引。磺酸盐基团通常作为阳离子交换树脂中的侧链存在。固定相可作为颗粒状材料或珠子使用，但现在预装柱也易于获得 : GE Healthcare，Sigma-Aldrich，Rohm and Haas，Sybron Chemicals，Edvotek 离子交换色谱试剂盒，Bio-Rad。可以通过改变缓冲液条件来释放与固定相结合的颗粒。
蛋白质上的电荷会影响其在离子交换色谱中的行为。蛋白质在其氨基酸侧链（包括其氨基和羧基末端）上包含许多可电离基团。这些包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链上的碱性基团以及谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和酪氨酸侧链上的酸性基团。溶液的pH值、侧链的pK值和侧链的环境会影响每个侧链上的电荷。pH值、pK值和单个氨基酸电荷之间的关系可以通过亨德森-哈塞尔巴尔赫方程来描述，该方程在其他地方有详细描述。
一般来说，随着溶液pH值的升高，蛋白质上酸性和碱性基团的去质子化会发生，使得羧基转化为羧酸根阴离子（R-COOH到R-COO-），铵基转化为氨基（R-NH3+到R-NH2）。在蛋白质中，等电点（pI）定义为蛋白质净电荷为零时的pH值。当pH > pI时，蛋白质具有净负电荷，当pH < pI时，蛋白质具有净正电荷。pI因蛋白质而异。这就是离子交换对分离蛋白质有用的原因。如果使用含有不止一种蛋白质的缓冲液和阴离子交换树脂，那么带负电荷最多的蛋白质将最受固定相吸引，因此最后洗脱，而带正电荷最多的蛋白质将首先洗脱。
离子交换过程可以分为四个基本阶段（参考文献1）
- 平衡
- 样品上样
- 洗脱
- 再生
此阶段涉及设置所需的起始条件，以便系统准备好进行离子交换过程。在此步骤中，施加具有所需条件的缓冲液，并且固定相中的所有带电基团都与带相反电荷的离子相关联。当此过程完成时，即达到平衡。
在此步骤中，将样品应用于固定相。只有带与固定相相反电荷的蛋白质才会与其结合，而带相同电荷或不带电荷的蛋白质则不会结合。这些未结合的颗粒将在此阶段洗脱。在上图色谱图中，蛋白质A从未与固定相结合并洗脱，形成第一个峰。
此步骤涉及改变缓冲液条件以洗脱已与固定相结合的颗粒。有几种不同的方法可以做到这一点。一种选择是改变缓冲液的pH值。如前所述，当蛋白质的pI与溶液的pH值相同时，蛋白质的净电荷将为零。因此，当缓冲液的pH值达到蛋白质的pI时，蛋白质的净电荷将为零。蛋白质将不再与固定相结合，并会被释放和洗脱。洗脱结合蛋白质的另一种方法是增加盐浓度。随着缓冲液盐浓度的增加，盐离子取代结合的蛋白质。离子相互作用较弱的蛋白质将在较低的盐浓度下释放。带电荷较强的蛋白质对固定相的亲和力较高，并将更长时间地结合在色谱柱上。在上图所示的色谱图中，由于条件的变化，蛋白质B被释放。红线表示应用于系统的某些梯度。当蛋白质B释放时，会产生第二个峰。
此步骤只需从固定相中去除所有结合的蛋白质，使其准备好进行另一个过程。
尽管阴离子交换剂所涉及的树脂带正电荷，但阴离子交换剂之所以得名，是因为其对阴离子的亲和性。为了有效结合蛋白质，系统中缓冲液的pH值必须大于目标蛋白质的等电点，因为蛋白质在其等电点以上带负电荷。
阴离子交换剂可以分为弱阴离子交换剂和强阴离子交换剂。弱交换剂上的带电基团是一种弱碱，由于去质子化作用，在高pH值下容易失去其电荷。另一方面，强阴离子交换剂由带电基团组成，该基团是一种强碱。强阴离子交换剂能够在可变的pH范围内维持其正电荷，而弱阴离子交换剂则随着pH值的升高而倾向于失去其电荷。阴离子交换剂的例子包括强阴离子交换剂Q（季铵树脂）和弱阴离子交换剂DEAE（二乙氨基乙烷）。
通常，色谱是在pH值为7到10的缓冲液中进行的，并从仅包含此缓冲液的溶液到包含此缓冲液和1M NaCl的溶液进行梯度洗脱 (Res1)。盐（在溶液中）与固定相的结合位点竞争，从而使蛋白质从其结合状态释放出来。蛋白质分离是因为竞争所需的盐量随蛋白质的外部电荷而变化。阴离子交换色谱已成功用于粗浆的纯化、蛋白质彼此分离、蛋白质浓缩以及从蛋白质制剂中去除带负电荷的内毒素 (Res1)。
离子交换在实践中。为了通过离子交换洗脱未知蛋白质，需要不同浓度盐和适当缓冲液的梯度，以测试在哪个盐浓度下洗脱我们所需的蛋白质。在阴离子交换的情况下，使用DEAE填充色谱柱。使用Bis-tris等缓冲液进行平衡、洗涤和洗脱。通常使用注射泵通过色谱柱泵送各种缓冲液。在进行离子交换之前，目标蛋白质首先在Bis-tris缓冲液中平衡。一些蛋白质可能在Bis-tris中沉淀，因此溶解度可能是离子交换过程中潜在的问题。色谱柱首先用不含盐的缓冲液平衡。常用的盐之一是氯化钠。制备包含逐渐增加盐浓度的缓冲液，例如50mM NaCl、100mM NaCl、150mM NaCl等。最后，使用1M NaCl缓冲液彻底清洗色谱柱。所有缓冲液都需要调节其pH值，因为蛋白质对pH值敏感。如图所示，收集浓度逐渐增加的盐的馏分。收集所有馏分后，取样进行SDS-PAGE。通过凝胶，我们可以确定在哪个盐浓度下洗脱了我们的蛋白质，以及分离效果如何。测试规模不需要大量的蛋白质混合物。在大规模蛋白质纯化中，含盐缓冲液可以从较高浓度开始作为有效的洗涤液。将从所有馏分中取样以跟踪我们的纯化过程。
阳离子交换剂因其吸引阳离子或带正电荷粒子的能力而得名。在这种情况下，色谱系统的树脂带负电荷，如果缓冲液pH值小于蛋白质的独特等电点，则蛋白质将结合。
与阴离子交换剂一样，阳离子交换剂也可以分为弱阳离子交换剂和强阳离子交换剂。弱阳离子交换剂由弱酸组成，随着pH值的降低，其电荷逐渐降低，而强阳离子交换剂由强酸组成，能够在较宽的pH范围内维持其电荷。羧甲基通常用作弱阳离子交换剂，而磺丙基则广泛用作强阳离子交换剂 (Res1)
选择正确的树脂和缓冲液至关重要，因为它决定了蛋白质与树脂的结合特性。在阳离子交换中，目标蛋白质需要带正电荷才能与带负电荷的固定相结合。假设我们有以下蛋白质的混合物
| 蛋白质 | pI | pH 4.8 cm | pH 7.2 cm | pH 8 cm |
| 碳酸酐酶 | 7.0 | +16.5 | -0.4 | -2.7 |
| 羧肽酶B | 6.2 | +12.0 | -3.3 | -6.3 |
| 胰凝乳蛋白酶 | 8.0 | +9.0 | +2.7 | 0.0 |
| 溶菌酶 | 9.8 | +14.1 | +7.9 | +6.9 |
- 在pH 4.8 cm时，所有蛋白质都将结合到阳离子交换剂上，其中碳酸酐酶与固定相的结合最强。如果在此pH值下进行洗脱，则蛋白质的洗脱顺序为胰凝乳蛋白酶、羧肽酶B、溶菌酶和碳酸酐酶。
- 在pH 7.2 cm时，碳酸酐酶和羧肽酶B将在洗涤过程中洗脱（在梯度开始之前），然后是胰凝乳蛋白酶，最后在盐梯度过程中洗脱溶菌酶。
- 在pH 8 cm时，只有溶菌酶将结合到固定相上，其他三种蛋白质将在洗涤过程中洗脱。
还可以优化溶剂A和B中的盐浓度，以便即使弱结合的蛋白质带正电荷，也能够在洗涤过程中从色谱柱上洗脱。例如，如果将pH 4.8 cm修改为在溶剂A中含有0.1 M NaCl，在溶剂B中含有0.2 M NaCl，您会发现结合最弱的蛋白质（胰凝乳蛋白酶）在洗涤过程中洗脱，而其他三种蛋白质在梯度过程中洗脱。
- GE Healthcare 离子交换动画
- Craig. P., 罗切斯特理工学院 离子交换色谱
- 可以在此处找到模拟离子交换色谱的在线JAVA小程序：Ionex模拟（有关如何设置实验和使用模拟运行实验的说明可在链接中找到）
- 离子交换图像
- Bio-Rad 离子交换色谱和产品
- Sigma-Aldrich 离子交换树脂和相关聚合物吸附剂
- 罗姆哈斯 离子交换树脂产品
- 恰当的时间采取正确的步骤。生物/技术，4，954-958（1986），Bonnerjera，J.，Oh，S.，Hoare，M.，Dunhill，P。
- 安玛西亚生物科学 离子交换色谱原理和方法*
- Vydac 生物分离中高效离子交换色谱的原理和应用 *
- Ellyn A. Daugherty 使用离子交换色谱分离蛋白质 *
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