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凝胶过滤色谱柱

凝胶过滤色谱法，也称为 '尺寸排阻色谱法'，'分子排阻色谱法' 或 '分子筛色谱法' 是一种最简单、最温和的技术，它根据分子大小差异（流体力学体积）分离分子。这种方法允许通过将凝胶过滤介质填充到色谱柱中，将每个多肽从其他不同大小的多肽中纯化出来。与离子交换或亲和色谱不同，通过色谱柱的馏分不与色谱介质结合。凝胶过滤色谱法的最大优势在于，可以根据样品的特性改变介质，以便进行进一步的 纯化。

当使用有机溶剂作为流动相时，化学家往往将其称为凝胶渗透色谱法。所使用的 缓冲液 或有机溶剂作为流动相，是根据特定蛋白质样品的化学和物理性质选择的。色谱柱的固定相只是碳水化合物聚合物珠，流动相以不同的速度穿过固定相，具体取决于分子的尺寸。该技术用于分析有机溶剂可溶性聚合物的摩尔质量分布。它是由 Grant Henry Lathe 和 Colin Ruthren 发明的，他们在英国伦敦的女王夏洛特医院工作。

凝胶过滤色谱法可以以两种不同的方式应用：用于群体分离和生物分子的高分辨率分级分离。群体分离技术根据尺寸范围将样品中的化合物分离成不同的组。该技术用于从高或低分子量污染物中纯化样品。生物分子的高分辨率分级分离是一种更精确的技术。它可用于分离样品中的一种或多种成分，分离单体与聚集体，确定分子量，或进行分子量分布分析。凝胶过滤色谱法非常适合对 pH 变化、金属离子浓度或辅因子非常敏感的生物分子。

在进行凝胶过滤色谱法并由色谱柱中特定孔径的珠子分离的分子尺寸范围内，物质的相对洗脱体积（即找到分子的馏分体积）与对其分子量的对数存在线性关系（假设分子具有相似的形状）。如果给定的凝胶过滤色谱柱用几种已知分子量的蛋白质校准，则可以根据其洗脱位置估算未知蛋白质的质量。

类比

为了理解（这只是概念上的，甚至不是对 ME 色谱法中实际发生情况的近似描述）为什么凝胶过滤有效，可以想象几个塑料球（或海绵或瑞士奶酪——任何有坑洞的物体都可以）悬浮在玻璃罐中。现在想象一下，你在一个桶里混合了沙子、小弹珠和高尔夫球；你把它倒进去。当你观看时，首先高尔夫球到达罐底，然后是弹珠，最后是一层沙子沉淀下来。为什么呢？基本上所有的沙子都进入了塑料球（或瑞士奶酪或海绵）的洞中，并且它往往从一个塑料球的内部掉到另一个塑料球的内部，大大减缓了沙子到达罐底的速度。弹珠只比塑料球的洞小一点，所以它们有时在掉下来的路上会掉进洞里，但有时也会弹出来；同样，塑料球减缓了它们的移动速度，但程度较轻。高尔夫球太大，无法进入塑料球的洞，因此它们直接穿过塑料球——最快最直接的路线。关键：沙子 = 小分子；弹珠 = 中等分子；高尔夫球 = 大分子；塑料球 = 多孔珠子；水罐 = 色谱柱和水溶液

通用程序

填充到色谱柱中的凝胶介质是由具有稳定物理和化学特性的球形珠子组成的多孔基质，例如无反应性和无吸附性。小分子可以进入珠子，但大分子不能。小分子分布在珠子内部和珠子之间的水溶液中，而大分子位于珠子之间的溶液中。这些珠子不溶于水，通常由高度水化的聚合物制成，例如葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺。在商业用途方面，使用 Sephadex、Sepharose 和 Biogel。这些商业珠子直径约为 100 微米，用于根据尺寸分离蛋白质。此外，二氧化硅或交联聚苯乙烯也可以用作珠子的材料，在更高的压力下使用。颗粒之间的孔隙和空间充满了液体缓冲液，这将填充整个色谱柱。填充孔隙空间的液体称为固定相，颗粒之间空间中的液体称为流动相。将样品应用到色谱柱顶部后，它会与流动相一起从色谱柱顶部到底部穿过色谱柱。较小的分子能够穿过并穿过这些聚合物珠子，但较大的分子不能。因此，色谱柱中的小分子既位于聚合物珠子内部，也位于珠子之间，而大分子只能在聚合物珠子之间移动。由于较大的珠子允许移动的空间较小，因此它们往往更快地向下移动色谱柱，并首先在色谱柱末端出现。这样想吧。穿过色谱柱的分子代表一个水龙头。如果水龙头允许水移动的空间体积较小，水就会更快地流出，并且力量更大。这里也适用同样的概念。由于较大的分子所能使用的体积较小，因此它们在色谱柱中的移动速度比较小的分子快得多。因此，由于小分子被困在珠子内部，因此它们往往移动得更慢。理论上，具有相同大小的分子应同时洗脱。可以构建洗脱图或色谱图以验证完全分离。在分离未知样品之前，可以运行含有已知生物分子的溶液以制作校准曲线，这可以作为后来识别未知分子的参考。

应用

凝胶过滤色谱法通常用于分析合成和生物聚合物，如核酸、蛋白质和多糖。该技术的缺点是，固定相也可能以不希望的方式与分子相互作用，影响其保留时间。该方法的主要缺点是难以产生高分辨率图像。解决这个问题的一种方法是不连续电泳。圆盘电泳使用具有不同 pH 值的凝胶，当蛋白质从一种凝胶移动到另一种凝胶时，蛋白质会产生清晰的条带，从而产生高分辨率图像。 该技术需要三种不同的凝胶：样品凝胶、堆积凝胶和运行凝胶。蛋白质通过堆积凝胶并在样品凝胶和运行凝胶之间移动，然后蛋白质才进入它们。这会压缩蛋白质并提高分辨率。

凝胶过滤色谱法不应与凝胶电泳混淆，在凝胶电泳中，施加电流以产生电场，根据分子的电荷通过凝胶将其分离到电极（阳极和阴极）。此外，在凝胶过滤色谱法中，大分子首先向下移动色谱柱，而在凝胶电泳中，小分子首先向下移动凝胶。

参考文献

Viadiu，Hector。生物化学 114A 讲座。“蛋白质技术”。2012 年 10 月 15 日