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凝胶过滤柱

凝胶过滤色谱，也称为 '尺寸排阻色谱'，'分子排阻色谱' 或 '分子筛色谱' 是一种最简单、最温和的技术，它根据分子大小差异（流体力学体积）分离分子。这种方法允许通过将凝胶过滤介质填充到色谱柱中，将每种多肽从其他不同大小的多肽中分离出来。与离子交换或亲和色谱不同，通过色谱柱的馏分不与色谱介质结合。凝胶过滤色谱的优点是，介质可以根据样品的性质进行变化，以进行进一步的纯化。

当使用有机溶剂作为流动相时，化学家往往将其称为凝胶渗透色谱。用作流动相的缓冲液或有机溶剂的选择基于特定蛋白质样品的化学和物理性质。色谱柱的固定相只是碳水化合物聚合物珠，流动相以不同的速度穿过固定相，这取决于分子的尺寸。该技术用于分析有机溶解聚合物的摩尔质量分布。它是由 Grant Henry Lathe 和 Colin Ruthren 发明的，他们当时在英国伦敦的皇后夏洛特医院工作。

凝胶过滤色谱可以以两种不同的方式应用：组分离和生物分子的高分辨率分离。组分离技术根据尺寸范围将样品中的化合物分成组。该技术用于从高或低重量污染物中纯化样品。生物分子的高分辨率分离是一种更精确的技术。它可用于分离样品中的一种或多种组分，分离单体和聚集体，确定分子量，或进行分子量分布分析。凝胶过滤色谱非常适合对 pH 变化、金属离子浓度或辅因子非常敏感的生物分子。

在通过凝胶过滤色谱分离并由色谱柱中特定孔径的珠子分离的分子尺寸范围内，物质的相对洗脱体积（即发现该分子的馏分的体积）与它的分子量的对数呈线性关系（假设分子具有相似的形状）。如果使用已知分子量的几种蛋白质对给定的凝胶过滤柱进行校准，则可以通过未知蛋白质的洗脱位置来估计其质量。

类比

理解凝胶过滤工作原理的一个类比（这是概念性的，与 ME 色谱中的实际情况甚至没有一点关系）是想象几个弹球（或海绵或瑞士奶酪——任何能容纳你的东西）悬浮在一个玻璃罐中。现在想象一下，你有一个装满沙子、小弹珠和高尔夫球的桶；你把它倒进去。当你观察时，首先高尔夫球到达水箱的底部，然后是弹珠，最后是一层沙子沉淀下来。为什么？基本上，所有的沙子都进入了弹球（或瑞士奶酪或海绵）的洞中，它往往从一个弹球的内部掉到另一个弹球的内部，大大减缓了沙子到达水箱底部的速度。弹珠只比弹球的洞小一点，所以它们有时会掉进洞里，但有时也会弹出来；同样，弹球会减缓它们的速度，但程度较小。高尔夫球太大，不适合弹球的洞，所以它们直接穿过弹球——最快最直接的路线。关键：沙子=小分子；弹珠=中分子；高尔夫球=大分子；弹球=多孔珠子；水箱=色谱柱和水溶液

一般程序

填充在色谱柱中的凝胶介质是一种多孔基质，由球形珠子组成，这些珠子具有稳定的物理和化学性质，如无反应性和无吸附。小分子可以进入珠子，但大分子不能。小分子在珠子内部和珠子之间水溶液中分布，而大分子位于珠子之间的溶液中。这些珠子不溶，通常由高度水合的聚合物制成，如葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺。出于商业目的，使用 Sephadex、Sepharose 和 Biogel。这些商业珠子直径约为 100 微米，用于根据大小分离蛋白质。此外，二氧化硅或交联聚苯乙烯也可以在更高的压力下用作珠子的材料。颗粒之间的孔隙和空间充满液体缓冲液，该缓冲液填充整个色谱柱。填充孔隙空间的液体称为固定相，颗粒间空间的液体称为流动相。一旦样品被施加到色谱柱的顶部，它就会与流动相一起从色谱柱的顶部到底部穿过色谱柱。较小的分子能够穿过并穿过这些聚合物珠子，但较大的分子则不能。因此，色谱柱中小分子既存在于聚合物珠子内部，也存在于珠子之间，而大分子只能在聚合物珠子之间移动。由于较大的珠子允许的移动空间较小，因此它们往往会更快地向下移动色谱柱，并且首先在色谱柱的末端出现。想想这个。沿着色谱柱移动的分子代表一个水龙头。如果水龙头允许水的移动空间较小，水将更快地流出，并以更大的力量流出。这里也适用相同的概念。由于较大分子可访问的体积较小，因此它们比较小的分子在色谱柱中移动得快得多。因此，由于小分子被困在珠子内部，它们往往移动得更慢。理论上，尺寸相同的分子应同时洗脱。可以构建洗脱图或色谱图来验证完全分离。在分离未知样品之前，可以运行具有已知生物分子的溶液以制作校准曲线，该校准曲线稍后可作为识别未知分子的参考。

利用

凝胶过滤色谱通常用于分析合成和生物聚合物，如核酸、蛋白质和多糖。该技术的缺点是固定相也可能以不良方式与分子相互作用，从而影响其保留时间。该方法的主要缺点是难以产生高分辨率图像。一种替代方法可能是间断电泳。盘式电泳使用具有不同 pH 值的凝胶，当蛋白质从一种凝胶移动到另一种凝胶时，蛋白质会产生清晰的条带，从而创建高分辨率图像。 该技术需要三种不同的凝胶：样品凝胶、堆积凝胶和运行凝胶。蛋白质在进入样品凝胶和运行凝胶之间移动，穿过堆积凝胶，然后蛋白质进入这些凝胶。这会压缩蛋白质并提高分辨率。

凝胶过滤色谱不应与凝胶电泳混淆，在凝胶电泳中，施加电流以产生电场，根据其电荷将分子通过凝胶分离到电极（阳极和阴极）。此外，在凝胶过滤色谱中，大分子首先迁移到色谱柱底部，而在凝胶电泳中，小分子首先迁移到凝胶底部。

参考文献

Viadiu，Hector。生物化学 114A 讲座。“蛋白质技术”。2012 年 10 月 15 日