结构生物化学/交联技术

交联是研究 蛋白质相互作用的一种方法，在涉及蛋白质时常称为生物偶联。交联涉及将蛋白质通过一个小的交联剂共价连接到另一个 大分子（通常是另一个蛋白质）或固体载体。交联剂或交联剂是至少具有两个反应性末端的分子，用于连接聚合物链。交联剂通常对蛋白质中常见的官能团有反应性，例如羧基、胺和硫醇。

交联剂类型

同双功能交联剂

同双功能交联剂是分子，在交联剂的每一端具有相同的反应性基团。同双功能交联剂可以很好地了解溶液或细胞中存在的分子之间的所有相互作用，但也可能引起不希望的交联。反应性末端是无偏的，可能会将蛋白质与相同蛋白质交联，而此时可能需要不同蛋白质之间的相互作用。同双功能交联剂通常还会产生分子内交联。

异双功能交联剂

异双功能交联剂是分子，在交联剂的每一端具有不同的反应性基团。异双功能交联剂在形成的交联中更具选择性，因为可以选择每个基团的反应性，以便特定蛋白质仅与一端结合。还可以建立一个两步法来最大限度地减少不希望的交联。首先，将交联剂添加到含有一种特定蛋白质的溶液中，并使其反应。然后，将连接有交联剂的蛋白质纯化，并添加到含有一种第二种蛋白质的溶液中，该蛋白质将与交联剂上的另一个反应性基团形成交联。然后可以使用不同的技术来分析这种新结构，以查看连接的蛋白质、连接的数量或其他所需信息。

交联剂反应基团

交联剂中使用了许多不同的反应性基团，这些基团针对蛋白质上的不同官能团，包括羧基、胺、硫醇和羟基。通常根据交联剂的反应性、长度和溶解度来选择交联剂。交联剂也可以在添加到样品后自发反应，或者在特定时间激活，通常通过光反应基团。

虽然可以选择交联剂仅针对特定类型的官能团，但大多数蛋白质都包含几个具有每种类型基团的残基。如果有多个目标位点可用于结合，则交联剂将失去特异性，并且将形成多个交联产物。但是，只有当目标官能团位于蛋白质表面时，交联剂才能结合。因此，蛋白质折叠通常会阻挡许多可能的反应位点的通路，从而提高交联的特异性。

N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS 酯）

NHS 酯与胺反应生成稳定的酰胺基团。因此，NHS 酯可用于连接到蛋白质的 N 端或赖氨酸残基。反应通常在弱碱性条件（pH 7.2-8.5）下进行。但是，所需的反应与 NHS 酯的水解竞争。水解速度随着 pH 值的升高而增加，因此必须更严格地控制缓冲溶液的 pH 值。

亚胺酯

亚胺酯是与伯胺形成脒的反应性基团。与 NHS 酯一样，亚胺酯可用于连接到蛋白质的 N 端或赖氨酸残基。亚胺酯的反应性随 pH 值的升高而增加，反应通常在 pH 8 到 10 之间进行。然而，亚胺酯在较高 pH 值下变得不稳定，因此不如 NHS 酯稳定。亚胺酯可用于连接膜蛋白，并用于探测脂质-蛋白质相互作用，因为它们能够穿透细胞膜。

碳二亚胺

碳二亚胺不是传统的交联剂，因为交联剂本身不会成为蛋白质-蛋白质复合物的一部分。碳二亚胺通过在一种蛋白质的羧酸基团和另一种蛋白质的胺基团之间形成酰胺键，直接将两种蛋白质共价连接在一起。由于碳二亚胺交联剂的机制，它们本质上是零长度（它们不会成为分子的一部分）和异双功能交联剂。EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）是唯一众所周知的碳二亚胺交联剂。

马来酰亚胺

马来酰亚胺在生理 pH 值下与硫醇反应生成稳定的硫醚键，通常与半胱氨酸残基连接。由于蛋白质中通常存在比胺基团少得多的游离硫醇基团，因此马来酰亚胺往往比针对胺的反应性基团更具特异性。此外，由于硫醇通常参与二硫键，因此连接到交联剂通常不会干扰蛋白质的结构。

卤代乙酰

与马来酰亚胺一样，卤代乙酰在生理 pH 值下与硫醇基团反应生成硫醚键。最常见的卤代乙酰是碘代乙酰和溴代乙酰，它们通过硫醇的硫对卤化物的亲核取代反应进行反应。

吡啶基二硫化物

吡啶基二硫化物与硫醇反应形成二硫键。它们在很宽的 pH 范围内都有活性，但 pH 4-5 为最佳。由于形成了二硫键，因此可以使用正常的二硫化物还原剂将该键裂解。

重氮甲烷

重氮基化合物是一种光敏基团的例子。虽然大多数其他反应性基团在添加到样品后会自发反应，但光敏基团在暴露于紫外光之前会处于惰性状态。蛋氨酸和亮氨酸的重氮基类似物通常被整合到蛋白质中，然后在样品溶液或细胞中被光活化。活化后，重氮基将与光敏类似物附近几埃范围内的任何蛋白质发生反应。这使得蛋白质-蛋白质相互作用能够在活细胞中被捕获和研究。

尽管进行了结构修饰，由蛋氨酸和亮氨酸的重氮基类似物制成的蛋白质仍然是可行的，尽管它们的生长速度略有下降。这使得能够创建无毒的光敏蛋白。因此，氨基酸类似物及其整合的蛋白质可用于研究体内蛋白质-蛋白质相互作用，而不会严重干扰细胞。

蛋白质交联应用

交联是一种很好的技术，可以了解更多关于蛋白质-蛋白质相互作用的信息。通常情况下，蛋白质之间的相互作用太弱而无法正常观察到，但通过交联，可以使这些相互作用固化并易于检测。这在确定细胞中的某些蛋白质是否相互作用，以及可能导致更多关于细胞如何运作的信息方面可能有用。交联的另一个用途是将蛋白质连接到固体基质上，以固定它们，以便更容易地分析它们。交联也可以用于将标签连接到蛋白质上，以帮助检测其存在。

可以选择具有不同反应端之间的长度的交联剂，这可以帮助确定蛋白质结构中某些功能基团之间的距离。例如：如果将几种具有相同反应端但具有不同长度的交联剂分别添加到含有待分析蛋白质的溶液中，那么根据哪个溶液发生了反应，就可以根据所添加的交联剂确定目标功能基团之间的距离。

蛋白质-蛋白质相互作用

可以使用交联剂来确定蛋白质之间的相互作用，实质上是在蛋白质相互作用时将它们冻结在一起。这种技术创造了一个稳定的蛋白质对，可以通过凝胶电泳或蛋白质印迹法进行纯化或研究。最常见的是表征体内蛋白质-蛋白质相互作用，其中可以在目标相互作用启动后的不同时间进行交联。由此产生的交联可以指示细胞在对某些刺激的反应过程中发生的相互作用。

使用交联剂研究蛋白质-蛋白质相互作用的另一种方法是使用可裂解的、标记的、光敏交联剂来标记与“诱饵”蛋白相互作用的任何蛋白。该标签可以是放射性同位素或质量变体。通常使用异双功能交联剂，一端连接到纯化的诱饵蛋白，另一端是光敏基团。光敏端可以通过紫外辐射在不同的时间被活化，这将导致它立即与遇到的第一个基团发生反应 - 希望是一个与诱饵蛋白相互作用的蛋白质或辅因子。然后可以裂解交联剂，将标签转移到另一个蛋白质或辅因子。

结构和亚基分析

交联剂可用于定量某些氨基酸，以及确定亚基的数量和它们之间的距离。使用仅在长度上不同的多个交联剂可以确定特定氨基酸功能基团之间的距离。这些信息可以用来确定氨基酸在二级、三级和四级结构中的相对位置。结合巯基的同双功能交联剂也可以用来用不可裂解的连接取代蛋白质中的二硫键。

免疫毒素

交联剂可以用来将毒素分子连接到针对肿瘤细胞的抗体上。抗体将与肿瘤细胞表面的抗原结合，交联的复合物被细胞吸收。一旦进入细胞内部，毒素就会释放并活化，杀死细胞。为了有效，交联的抗体-毒素必须是稳定的，并且能够在体内定位和靶向正确的细胞。

免疫毒素需要一个可裂解的交联剂，以便毒素在进入细胞后被释放。SPDP是用于免疫毒素最常见的交联剂之一，它包含一个NHS酯和一个吡啶基二硫键。NHS酯首先连接到抗体，然后吡啶基二硫键连接到毒素。由于许多毒素没有表面巯基，因此通过还原二硫键来产生游离巯基。一些使用的毒素是蓖麻毒素和相思豆毒素。

蛋白质-蛋白质共轭

蛋白质-蛋白质共轭物在 ELISA 和蛋白质印迹等许多免疫检测方法中使用。通常，酶连接到针对目标抗原的特定抗体。抗体将与抗原结合，连接的酶将催化可检测的反应，表明抗原的存在。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶是最常用的酶，因为它们产生的产物很容易通过光谱法检测到。

小的肽抗原也可以与更大的蛋白质结合，以生产免疫原。免疫原通常通过将动物（通常是老鼠）注射抗原并收集动物响应产生的抗体来制备。小的肽通常不够大，无法在动物体内产生抗原反应，因此与更大蛋白质的连接对于产生有效的抗原可能是必要的。

固相固定化

交联剂可用于将蛋白质连接到固体支持物上，方法是选择含有交联剂一端特异性识别的功能基团的固体树脂。将蛋白质连接到固体支持物上，可以进行亲和纯化和蛋白质分析。其他生物分子，如 DNA，也可以通过类似的方式连接到固体支持物上。尽管 DNA 交联受到缺乏交联剂通常靶向的功能基团的阻碍，但可以通过在特定碱基上添加伯胺或硫醇来修饰 DNA，以增加交联剂活性。