结构生物化学/DNA重组技术/噬菌体λ的历史与研究
观察到其线性基因组在进入宿主细胞时通过互补碱基配对形成一个环。基因组能够以如此奇特的方式起作用,是因为存在称为粘性末端(cos)的单链区域。这些cos位点能够碱基配对,这些位点的性质与由限制性内切酶产生的位点相同。(例如:EcoR1产生“粘性末端”。)这个环状噬菌体DNA能够通过附着位点与宿主细胞DNA重组。带有某些细菌基因的噬菌体后代通过溶原途径产生。使λ噬菌体非常有利的是,它可以破坏其宿主(裂解途径)或成为其宿主的一部分(溶原途径)。对这些替代循环控制的研究对我们理解基因转录调控非常重要。
λ噬菌体是一种病毒颗粒,由一个头部组成,头部由双链线性DNA作为其遗传物质,以及一条尾巴。它通过尾部将自身DNA注入宿主细胞,此时噬菌体将进入裂解或溶原途径。λ噬菌体48kb的DNA中很大一部分对有效感染并不重要,可以被外源DNA取代,因此使λ噬菌体成为理想的载体。
λ噬菌体最初由Esther Lederberg于1950年从大肠杆菌中分离出来。它是一个被深入研究的生物体,并且一直是分子生物学中一个有用的工具。λ噬菌体可以用于重组DNA的克隆,使用其位点特异性重组酶(int)通过“Gateway”方法对克隆的DNA进行重排,以及在重组工程中。λ噬菌体的发现和研究导致了对转导的理解,这为解释进化模式提供了主要机制。
Allan Campbell在1962年研究了噬菌体λ,他研究了噬菌体的整合过程。他观察到λ噬菌体有一个独特的特征,一些噬菌体会在某些大肠杆菌菌株中感染并繁殖,而其他菌株似乎具有免疫力。进一步探究这种情况发生的原因导致发现免疫菌株包含一个休眠的噬菌体拷贝,但休眠的拷贝可以被激活。对噬菌体λ的研究为病毒生命周期、遗传物质的调控和表达,以及遗传物质的整合和切除机制提供了宝贵的贡献。
突变噬菌体经过基因设计,使克隆更容易。其中一个特别有用的突变体称为λ(gt)-(λ)(β),它只包含两个EcoRI切割位点,而不是正常的五个。切割后,该噬菌体DNA的中间片段可以被去除,留下72%的正常基因组长度,这太短了,无法包装成λ颗粒。因此,λDNA片段之间的适当长度的DNA插入物使重组DNA分子能够被包装。这些经过修饰的病毒比质粒更容易进入细菌。
基因组文库是一个大型的DNA片段集合。这些文库有助于识别具有感兴趣基因的DNA片段。创建基因组文库利用λ噬菌体。首先,将总基因组DNA机械剪切,以产生随机重叠的DNA片段群体,这些片段通过凝胶电泳分离。所有长度约为15kb的片段都被分离出来,并与合成接头连接,以插入到λ噬菌体中,λ噬菌体复制自身,然后裂解其细菌宿主。产生的裂解液包含装在病毒颗粒中的DNA片段,这些片段构成基因组文库。
限制:在一种细菌细胞中生长的噬菌体无法在其他细菌菌株中生长。在某些细菌菌株中观察到λ噬菌体DNA的降解。后来发现这是限制性内切酶的结果,限制性内切酶会检测到噬菌体DNA是外源的,然后切割它。因此,限制性内切酶被称为限制性内切酶,因为它们能够限制外源DNA。
修饰:对噬菌体进行修饰,使其能够在其他细菌菌株中正常生长。修饰的一个例子是λ噬菌体DNA的甲基化,这样它就不会被限制性内切酶切割。
Allison等,基础分子生物学,2007。