结构生物化学/DNA 重组技术/质粒/裂解途径
在裂解途径中,包含病毒 DNA 的 λ 噬菌体附着到细菌细胞上。然后将病毒 DNA 插入含有质粒 DNA 的宿主细胞。来自 λ 噬菌体的病毒 DNA 不会被引入质粒,而是保留在细胞中。来自 λ 噬菌体的病毒 DNA 利用宿主细胞的细胞机制快速复制病毒 DNA。然后,复制的病毒 DNA 被包装到由病毒蛋白制成的病毒颗粒中。然后,病毒利用宿主细胞的机制和代谢来驱动病毒 DNA 包装到蛋白质外壳中。在后代 λ DNA 复制并包裹后,宿主细菌裂解或破裂并释放大量 λ 噬菌体副本,以重复对其他宿主细胞的过程。
λ 噬菌体也是用于 DNA 克隆的载体。它是一种含有双链噬菌体 DNA 的病毒,可以被引入大肠杆菌进行复制。已经创建了突变的 λ 噬菌体,使克隆更容易。一个例子是 λ-gt-λ-β 噬菌体。它包含两个 EcoRI 限制性内切酶位点。噬菌体 DNA 的中间部分通过限制性消化被去除。剩余的两个 DNA 臂无法包装成 λ 病毒体,因为它太小了。相反,外源片段的目标 DNA 与两个臂一起用连接酶连接,它取代了被去除的中间部分。添加外源 DNA 使噬菌体 DNA 足够长,可以包装成病毒体。然后,包装的 λ 病毒体可以被插入宿主细胞,然后通过裂解或溶源途径被替换。
基因组文库是指成千上万个重组质粒克隆的完整集合,每个克隆都携带来自初始基因组的特定片段的副本。研究人员可以保存这样的文库,并将其用作基因兴趣的来源或用于基因组作图。使用噬菌体构建的基因组文库保存在噬菌体克隆的集合中,无论使用何种克隆载体,限制性内切酶在切割基因组 DNA 时都不会尊重基因边界,因此基因组文库中的一些基因可能会被分成两个或多个克隆。
λ 噬菌体也可用于容纳基因组文库。首先,通过酶消化将基因组 DNA 片段化。所需的片段约为 15 千碱基对长,可以通过凝胶电泳分离。合成接头连接到片段的末端。然后将片段引入突变的噬菌体 DNA 中,然后包装成病毒体。将病毒体引入大肠杆菌宿主,然后产生许多噬菌体 DNA 的副本。然后,后代病毒体包含一个基因组文库,其中包含已片段化的 DNA。可以筛选基因组文库以分离特定的感兴趣基因。
研究人员能够使用互补 DNA (cDNA) 制备更有限类型的基因文库。一旦他们能够从细胞中分离出 mRNA,他们实际上就可以获得细胞中所有从许多不同基因转录的 mRNA 分子的混合物。因此,制成的 cDNA 是基因集合的文库。cDNA 仅代表细胞基因组的一部分——在起始细胞中转录的基因。
这种基因组文库有其优势,例如,如果研究人员想要研究负责特定类型细胞(例如肝脏或脑细胞)特定功能的基因,则更小、更具体的文库允许以更详细的方式进行此操作。此外,通过从同一生物体的相同类型细胞中在不同时间制造 cDNA,研究人员可以追踪基因表达中发生的改变。
裂解噬菌体裂解生命周期共有六个阶段。这六个阶段是吸附、穿透、复制、成熟、释放和再感染。
在裂解噬菌体生命周期的第一阶段,噬菌体上的附着位点吸附在宿主细胞的受体位点上。噬菌体通常附着在细胞的细胞壁上,有时也会附着在细菌的鞭毛或菌毛上。
在第二阶段,噬菌体具有特定的酶,该酶在细胞壁上打一个洞,然后将噬菌体的基因组插入细胞的细胞质中。将基因组插入细胞的另一种方法是制造一根进入细菌的空心管。这被称为“收缩鞘”。
在第三阶段,噬菌体的基因组插入细菌细胞后,细胞随后会关闭 RNA、DNA 和蛋白质的合成。同时,噬菌体利用细胞的代谢成分制造噬菌体酶,从而复制自身的基因组。
在成熟阶段,基因组缓慢地围绕自身生成,为下一阶段做准备。
当来自噬菌体基因组的溶菌酶分解肽聚糖时,就会发生释放阶段。这会导致细胞的渗透裂解,噬菌体被释放到细胞外部。
这个被感染的细菌可能会产生大约 50 到 200 个噬菌体。因此,在噬菌体释放后,它们可以去感染周围的其他细菌细胞。
在 1960 年代初期,人们发现了一种含有 recA 基因的特殊 λ 转导噬菌体,它对大肠杆菌细胞的同源重组至关重要,但该产物从未被分离出来。罗伯特·莱曼和他的团队决定进行这项实验。recA 蛋白具有依赖于单链 DNA 的 ATP 酶活性,这意味着它依赖于 DNA ATP 酶。RecA 蛋白可以促进复性(即变性的相反过程)的发生,该过程是互补的单链的,但它也可以促进 ATP 依赖性的单链与同源 DNA 双链之间的链交换。它还可以形成 Holliday 连接,这是重组中的关键因素,其中 DNA 被重新排列以形成多样性。Lehman, Robert. DNA 酶学家的漫游:从 DNA 聚合酶到病毒潜伏。Annu. Rev. Biochem. 2006 年 1 月 16 日。