结构生物化学/核酸/DNA/复制过程/DNA聚合酶
DNA复制的完整过程包括20多种蛋白质的错综复杂的协调相互作用。1958年，阿瑟·科恩伯格及其同事从大肠杆菌中分离出DNA聚合酶。DNA聚合酶是第一个已知的酶，其功能是促进构成DNA骨架的连接单元的键形成。大肠杆菌拥有各种数量的DNA聚合酶，用罗马数字表示，在DNA复制和修复中发挥重要作用。
DNA聚合酶是一种酶。这种酶从旧的DNA模板合成新的DNA链，并修复DNA以避免突变。DNA聚合酶催化形成磷酸二酯键，构成DNA分子的骨架。它在催化活性中使用镁离子来平衡来自磷酸基团的电荷。
核苷酸只能添加到新链的3'端；它不可能独自开始一个新的链。另一种DNA聚合酶的功能是错误校正 - 校正新DNA链中出现的错误。整个DNA聚合酶家族包括7个不同的亚组：A、B、C、D、X、Y和RT。真核生物至少有15种不同的DNA聚合酶。然而，真核聚合酶都不能去除引物，只有延伸聚合酶可以校对序列。
尽管存在不同类型的DNA聚合酶，但它们都具有共同的结构特征。此外，即使DNA聚合酶在细节上差异很大，但它们在总体形状上非常相似。已经鉴定出至少5个结构类别的DNA聚合酶。它们呈手的形状，具有特定的区域，称为手指、手掌和拇指。在所有类别的DNA聚合酶中，拇指和手指包裹着DNA，将其固定在酶的活性位点，而手掌释放构成该活性位点的残基。此外，所有DNA聚合酶在催化反应时都使用类似的策略。
DNA聚合酶是逐步将脱氧核苷酸单元添加到DNA链中的催化剂。催化的反应是
(DNA)n + dNTP ↔ (DNA)n+1 + PPi
其中dNTP代表任何脱氧核苷酸，PPi是焦磷酸根离子。
1. 反应发生需要所有四种活化的前体，脱氧核苷酸5'-三磷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP，以及Mg2+离子。通常，两种金属离子将参与反应。一种将与引物相互作用，而另一种与dNTP相互作用。dNTP中残基的羧酸根基团将两种金属离子固定到位。
2. 新的DNA链直接在已存在的DNA模板上构建。只有当进入的核苷酸三磷酸的碱基与模板链的碱基互补时，DNA聚合酶才能在形成磷酸二酯键中有效地作为催化剂发挥作用。换句话说，DNA聚合酶是一种酶，它通过将现有的DNA链作为模板进行解释来合成产物，并将模板的互补序列生成到新的链中。
3. DNA聚合酶需要引物的存在才能开始合成。DNA聚合酶催化的延长链反应是生长链的3'OH末端对脱氧核苷酸三磷酸的最内层磷原子的亲核攻击。因此，从一开始，必须将具有游离3'-OH基团的引物链与模板链结合。这种引物是通过RNA合成形成的。由于RNA可以在没有引物的情况下形成，因此它启动了DNA的合成。一旦形成互补DNA并启动合成，RNA片段将被去除，然后替换为正确的DNA序列。磷酸二酯桥是从反应中形成的，并且释放出焦磷酸。随后焦磷酸水解产生两个正磷酸离子（Pi），这有助于推动聚合反应向前进行。这种DNA链的延伸过程在5'-到-3'方向上进行。
4. 许多DNA聚合酶能够去除错配的核苷酸，作为DNA错误校正的一种方法。这些聚合酶具有独特的核酸酶活性，使它们能够通过单独的反应消除不正确的碱基。DNA聚合酶将反转其方向一个碱基对，切除不正确的碱基以用正确的碱基替换它，并继续进行其余的复制。由于这种3'到5'外切核酸酶活性，DNA复制具有非常高的可靠性。这个步骤过程也被称为校对。然而，它并不完全完美，这就是为什么自然突变和相关疾病仍然可能出现的原因。
DNA聚合酶在DNA合成中起着关键作用。如果没有这些参与者，生命将不复存在。这些聚合酶是多亚基复合物，功能非常独特。它需要不同的成分协同工作才能有效地发挥作用。聚合酶作用于单链链（特别是模板），以合成互补的链。在真核细胞中，有5个DNA聚合酶家族。这些可以编码为不同的（多达15个）酶。对于DNA复制至关重要的是三种DNA聚合酶：聚合酶α-引发酶、聚合酶δ和聚合酶ε。这三种聚合酶在DNA链的复制叉处起作用。DNA链被MCM解旋酶解旋，该解旋酶是CMG复合物（Cdc45-MCM-GINS）的一部分。正是聚合酶α-引发酶启动了前导链和滞后链的复制。正是这里，RNA引物（大约10个核苷酸）被放置下来。
启动后，聚合酶δ和ε被带到复合物中并被拴住。它们的功能是提高不同酶的生产力。具体来说，Pol δ在滞后链上合成，而Pol ε在前导链上合成。这些聚合酶的作用是通过遗传实验发现的。对于Pol ε，在活性位点上放置了一个突变。这增加了酶活性的速率，并在活性区域留下了印记。通过使用报告基因，证明了Pol ε确实参与了前导链的合成。对Pol δ进行了相同的遗传操作，以证明其在滞后链中的活性。
在碱基的实现过程中，需要一致的正确性。幸运的是，每10,000个复制的碱基对只发生一次掺入。但是，当它确实发生在DNA引物链中时，它必须从聚合酶中移出并进入外切核酸酶域。在那里，它被校对并允许继续稳定的域。[1]
作为生命活动的核心，聚合酶一直是结构和功能研究的重点。迄今为止，已经发现了 7 个不同的聚合酶家族（或结构域）。其中 5 个家族是真核细胞特有的，而其余家族则在细菌和古细菌中独有。这些聚合酶家族都具有一个核心结构，包括掌、指和拇指结构域。不同家族的聚合酶在核心结构的基础上演化出不同的细胞功能。这 7 个家族分别用字母 A、B、C、D、X、Y 和逆转录酶来表示。A 家族包括 Pol I 聚合酶，负责修复核苷酸。该家族还包括冈崎片段，参与滞后链的复制。B 家族包括真核聚合酶 sigma、alpha 和 epsilon。C 家族包含聚合酶 III，其功能是 XXX。D 家族包括仅存在于古细菌中的聚合酶。X 家族和 Y 家族则包含参与修复的酶。
正如之前提到的，聚合酶是多亚基实体，因此它们非常复杂。其结构由一个大的催化亚基（属于 B 家族的一部分）和许多其他小的亚基组成。B 家族聚合酶的结构是统一的：一个 N 端结构域，3’-5’ 外切核酸酶结构域，掌、指和拇指结构域；呈环状结构。所有真核聚合酶的催化亚基被认为是相关的，并来自基因重复的共同祖先。但研究表明，ε 的催化亚基比其他两个亚基更大，因为存在额外的序列。
获得高分辨率的结构对于进一步分析聚合酶至关重要。迄今为止，在确定构成聚合酶的不同亚基的结构方面已经取得了很大进展，但仅限于低分辨率。第一个报道的结构是 Pol ε 的冷冻电镜结构。研究人员的目标是获得高分辨率结构，因为它可以帮助进一步理解 DNA 合成的保真度以及所有真核细胞中保持的高度调控基因组。此外，它还可以用于设计遗传实验，以探索复合物之间和内部的相互作用。[2]
[1]
Bruno P. Klaholz 著“翻译终止复合物中的分子识别与催化”。IGBMC（遗传学与分子细胞生物学研究所），结构生物学与基因组学系，法国伊尔基希，F-67404。生物化学趋势，2011 年 5 月，第 36 卷，第 5 期
[2]
“真核生物类别的晶体结构和功能分析”。Mol. Cell 14, 233-245。Kong, C. 等人（2004）